基于抗原组学技术筛选与鉴定尖吻蝮蛇蛇毒保护性抗原

发布时间：2017-10-25 22:22

  本文关键词：基于抗原组学技术筛选与鉴定尖吻蝮蛇蛇毒保护性抗原

  更多相关文章： 尖吻蝮蛇 多克隆抗体 噬菌体肽库 抗蛇毒血清

【摘要】：蛇类在地球上有着广泛的分布，目前已被发现的蛇类多达3000多种，其中只有15%的蛇类是具有毒性的，对人类健康造成威胁。毒蛇咬伤主要发生在热带和亚热带农村地区，特别是低收入国家农村地区，因此许多毒蛇咬伤病例未予报告，造成流行病学资料缺失，蛇伤的具体发病情况难以得到正确统计。据报道，全球每年大约有2500000蛇咬伤病例发生，大约有125000人因毒蛇咬伤死亡。在2009年，世界卫生组织（WHO）首次承认，蛇咬伤是一个被长期忽视的公众健康问题。 尖吻蝮蛇是我国特有的蛇种，主要分布在中国南方地区，其分泌的毒液中含有多种毒素成分，目前研究较多的毒素成分是金属蛋白酶（Metalloproteinase）、磷酯酶A2（PhospholipaseA2）、丝氨酸蛋白酶（Serine proteases）、C型凝集素（C-type lectin-likeprotein）。尖吻蝮蛇蛇毒具有很强的血液毒性，中毒后常造成全身系统性的出血，局部组织坏死，给临床治疗带来困难。 噬菌体展示肽库技术是近几年来发展起来的，用于模拟抗原研究的新技术，这一技术现已成功的运用于模拟抗原筛选，并能诱导动物产生免疫应答，其基本原理是：在噬菌体表面插入各种组合的氨基酸短肽，通过抗原抗体识别反应，使含有特定蛋白的噬菌体，从肽库中筛选出来，通过测序获得特定蛋白的结构和功能信息。现这一技术在确定抗原表位、筛选小分子模拟肽、疫苗开发、分子诊断等领域得到了广泛应用。 研究目的：利用尖吻蝮蛇蛇毒免疫新西兰兔，通过实验纯化制备特异性尖吻蝮蛇蛇毒多克隆抗体，并通过动物实验检测多克隆抗体的生物活性；在纯化尖吻蝮蛇蛇毒多克隆抗体的基础上，利用噬菌体展示肽库技术，筛选与鉴定尖吻蝮蛇蛇毒保护性抗原，并采用基因工程技术，合成、表达重组抗原肽，对重组抗原肽免疫保护效应进行评估,从而为新型抗蛇毒血清的研究奠定基础。 研究内容和方法： 第一部分：以尖吻蝮蛇蛇毒免疫新西兰兔，并利用Econo-Pac ProteinAkit及CNBractivated sepharose4B凝胶对兔源性抗蛇毒抗体进行纯化，制备特异性尖吻蝮蛇蛇毒多克隆抗体，，用Western blot和ELISA对抗体进行评价，通过出血抑制实验及致死性保护实验评价抗体的生物活性。 第二部分：以抗尖吻蝮蛇蛇毒多克隆抗体为靶蛋白，对噬菌体随机肽库进行三轮生物淘选，获得与抗体特异性结合噬菌体阳性克隆，通过ELISA法和Western blot测定噬菌体单克隆与抗体的结合力，进一步筛选阳性克隆，对候选阳性克隆进行测序，得到插入短肽氨基酸序列，利用基因工程技术，对筛选获得的抗原片断进行串联重组表达，获得重组抗原肽，将重组抗原肽免疫BALB/C小鼠，并通过出血抑制实验，评估重组抗原肽的免疫保护效果。 主要实验结果： 1）成功地制备了抗尖吻蝮蛇蛇毒多克隆抗体，通过ELISA法检测，抗蛇毒抗体滴度＞1:3200；Western blot分析示：多克隆抗体与蛇毒中大多数毒素蛋白结合；体外出血抑制试验显示该抗体能有效地抑制尖吻蝮蛇蛇毒所导致的皮内出血；在致死性保护实验中，多克隆抗体对2LD50和4LD50蛇毒分别起到100%和54%的保护作用。 2）在本研究中，利用噬菌体展示肽库技术筛选出5个抗原表位，将该部分抗原进行串联重组表达，获得重组抗原肽，通过ELISA实验证明，重组抗原肽能有效的刺激小鼠产生抗体，该抗体能与重组抗原肽结合，也能被蛇毒抗原识别，与重组抗原肽识别滴度达到1:64000，与蛇毒识别滴度达到1:8000。在体外出血中和试验中，重组抗原肽免疫小鼠血清能100%抑制2MHD尖吻蝮蛇蛇毒所致的皮内出血，能减少82%的由4MHD蛇毒所致的皮内出血面积。 结论本研究通过噬菌体展示肽技术，筛选与鉴定出5个抗原表位，这些抗原表位具有较好的免疫保护性，从而为新型抗蛇毒血清的研究与开发奠定了基础。
【关键词】：尖吻蝮蛇 多克隆抗体 噬菌体肽库 抗蛇毒血清
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R646
【目录】：

• 缩略语表4-6
• Abstract6-9
• 摘要9-11
• 第一章 前言11-16
• 第二章 尖吻蝮蛇蛇毒多克隆抗体纯化及生物活性研究16-34
• 2.1 实验材料与试剂16-18
• 2.2 实验方法18-27
• 2.3 实验结果27-31
• 2.4 讨论31-34
• 第三章 随机肽库技术筛选与鉴定尖吻蝮蛇保护性抗原34-53
• 3.1 实验材料与试剂34-36
• 3.2 实验方法36-43
• 3.3 实验结果43-50
• 3.4 讨论50-53
• 全文总结53-54
• 参考文献54-58
• 附件58-66
• 文献综述66-79
• 参考文献74-79
• 攻读硕士期间发表文章目录79-80
• 致谢80

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前3条

1 周亚丽;劳兴珍;袁玲;柳萌;郑珩;;免疫球蛋白结合结构域的研究进展[J];药物生物技术;2012年03期

2 黄春洪;孔毅;吴杰连;刘睿;吴梧桐;;尖吻蝮蛇毒素组双向电泳和二维液相色谱研究[J];中国药科大学学报;2006年02期

3 牛立文;滕脉坤;朱中良;高永翔;张平;;若干蛇毒蛋白的结构生物学研究[J];中国科学技术大学学报;2008年08期

本文编号：1095766