miR-494对脂多糖诱导的人近端肾小管上皮细胞凋亡的影响

发布时间：2017-11-02 00:02

  本文关键词：miR-494对脂多糖诱导的人近端肾小管上皮细胞凋亡的影响

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【摘要】：目的:观察mi R-494在脂多糖(LPS)诱导人肾小管上皮细胞(HK-2)中的表达变化,并进一步探讨mi R-494对HK-2细胞凋亡的调控作用及其机制。方法:1、体外培养HK-2,给予1 ug/ml LPS分别干预0 h、1 h、3 h、6 h、12 h。采用Real-time PCR检测mi R-494的表达变化。2、构建mi R-494慢病毒过表达及阴性对照载体,转染HK-2细胞,荧光显微镜下估算转染效率。3、将HK-2分为四组:control组、LPS刺激组、mi R-494过表达+LPS组、mi R-494阴性转染+LPS组,除control组外,各组细胞予以相应处理后再均以1ug/ml LPS干预6 h。用Real-time PCR检测各组mi R-494、ATF3的表达水平。Annexin V-FITC/PI流式细胞法分别检测各组细胞的凋亡率。采用ELISA法检测各组细胞培养液中IL-6、TNF-α的浓度。结果:1、LPS刺激1 h后,HK-2细胞中mi R-494的表达水平即达到顶峰,为0 h组的3.19±0.21倍(P0.05),3 h、6 h和12 h的表达量逐渐下降,与0 h组的mi R-494表达量均有统计学意义。2、LV-mi R-494慢病毒表达载体转染72 h后荧光显微镜下观察Zs Green绿色荧光,细胞转染效率均达80%以上,q PCR检测LV-mi R-494+LPS组细胞mi R-494较control组的表达水平为8.57±0.50倍(P0.05),差异有统计学意义,提示转染成功。3、与control相比,LV-mi R-494+LPS组、LV+LPS组及LPS组的mi R-494表达水平分别为(8.57±0.50 vs 2.47±0.04 vs 2.34±0.02);ATF3 m RNA表达水平为(2.12±0.37 vs 5.84±0.42 vs 5.45±0.53),差异均有统计学意义(P0.05)4、流式细胞检测各组HK-2细胞凋亡水平:与control组比较,LPS组、LV-mi R-494+LPS组及LV+LPS组的细胞凋亡率明显高于control组(P0.05),LV+LPS组与LPS组比较,差异无统计学意义(P0.05)。5、ELISA法检测各组细胞IL-6、TNF-α的浓度:在LPS刺激下LV-mi R-494+LPS组、LV+LPS组、LPS组IL-6、TNF-α蛋白水平较control组均显著提高,且LV-mi R-494+LPS组与其它两组相比,IL-6、TNF-α蛋白水平显著升高,差异有统计学意义(P0.05),表明mi R-494的过表达对LPS诱导HK-2细胞释放IL-6、TNF-α有促进作用。结论:1、LPS可诱导HK-2细胞凋亡。2、重组慢病毒转染HK-2后,mi R-494表达明显上调,其靶基因ATF3表达下调。3、过表达mi R-494可显著促进炎性因子的释放,增强LPS的促凋亡作用,此作用机制可能是通过靶向抑制ATF3基因实现的。
【关键词】：微小RNA-494 脓毒症 急性肾损伤 凋亡 慢病毒
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R459.7
【目录】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-10
• 第1章 前言10-13
• 第2章 材料与方法13-23
• 2.1 实验材料13-14
• 2.1.1 实验细胞13
• 2.1.2 慢病毒载体构建13
• 2.1.3 实验仪器及设备13
• 2.1.4 主要试剂13-14
• 2.2 器材准备及主要溶液配置14-16
• 2.2.1 细胞培养器皿的灭菌处理14
• 2.2.2 去m RNA酶处理14
• 2.2.3 主要溶液配置14-16
• 2.3 实验方法16-22
• 2.3.1 细胞培养16-17
• 2.3.2 miR-494慢病毒及阴性对照慢病毒的构建和转染17
• 2.3.3 实验分组17-18
• 2.3.4 miR-494慢病毒感染HK-2 细胞18
• 2.3.5 qRT-PCR检测各组HK-2 细胞相关基因的表达18-21
• 2.3.6 ELISA法检测各实验组HK-2 细胞上清液IL-6、TNF-α 蛋白的表达21-22
• 2.3.7 流式细胞术检测各组细胞凋亡情况22
• 2.4 统计学方法22-23
• 第3章 结果23-30
• 3.1 HK-2 细胞形态学观察结果23
• 3.2 慢病毒转染HK-2 细胞形态学观察结果23-24
• 3.3 Real-time PCR检测结果24-27
• 3.3.1 总RNA琼脂糖凝胶电泳24
• 3.3.2 miR-494在LPS诱导HK-2 细胞中的动态表达变化24-25
• 3.3.3 慢病毒转染后细胞内miR-494、ATF3 m RNA的表达水平25-27
• 3.4 ELISA检测各组HK-2 细胞中IL-6、TNF-α 蛋白的表达水平27-28
• 3.5 流式细胞术检测各组HK-2 细胞凋亡率28-30
• 第4章 讨论30-35
• 4.1 体外模型的建立30-31
• 4.2 LPS诱导后HK-2 的miR-494的差异性表达31-33
• 4.3 过表达miR-494调控LPS诱导的HK-2 细胞凋亡33-35
• 第5章 结论与展望35-36
• 5.1 结论35
• 5.2 不足与展望35-36
• 致谢36-37
• 参考文献37-40
• 综述40-48
• 参考文献46-48

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前4条

1 赵俊丽;王俭勤;王晶宇;;LPS通过TLR4信号通路诱导人肾小管上皮细胞株(HK-2)表达hBD-2[J];免疫学杂志;2013年03期

2 须静;胡晓波;;中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的研究进展[J];检验医学;2012年10期

3 朱晓霞;李学农;郭煜;;慢病毒介导的RNA干扰对鼻咽癌细胞株中转移相关基因1的沉默效应[J];解放军医学杂志;2010年07期

4 杜志明;江柏青;;ATF3与肿瘤的研究进展[J];赣南医学院学报;2010年01期

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本文编号：1129074