《中国人民解放军军事医学科学院》2014年硕士论文

  本文关键词：基于脱细胞基质支架材料的肝脏组织工程研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：肝脏是人体内最大的器官，是物质代谢的中枢，在葡萄糖代谢、脂质代谢、蛋白合成以及解毒方面都发挥着重要的作用。当前肝炎、肝硬化、肝癌等肝脏疾病正严重威胁着人类健康，全世界由肝疾病引发的死亡率达到2.5%，其中最严重的是肝功能衰竭。我国是世界上病毒性肝炎和肝癌发病人数最多的国家，每年因肝病死亡的人数近50万，每年用于治疗肝炎和肝病的医疗、保健费用高达1000多亿元。急性肝功能衰竭预后不良，死亡率高达70%～80%。目前，针对急、慢性肝衰竭患者，肝移植是最有效的治疗方法，但由于可供移植的肝脏严重短缺，大多数患者在等待供体肝脏的过程中死亡。因此，寻找新的疗法或肝脏功能替代品已成为临床上亟需解决的问题，采用肝脏组织工程技术体外再造肝脏，有望为肝衰竭提供新的治疗手段。 组织工程是将工程学、材料学与生命科学的原则应用到开发生物代替物的前沿交叉学科领域，其核心内容是建立三维复合体，即体外构建具有生物学功能的工程化组织。肝脏组织工程研究始终是组织工程研究的热点领域之一，在近三十年的发展过程中，已取得了诸多突破性进展。研究表明，体外再造肝脏具有一定的肝衰竭等肝脏疾病治疗作用，系列核心技术在生物人工肝效能提升与更新换代方面发挥了重要作用。尽管如此，由于肝脏结构与功能的复杂性，体外构建组织工程化肝脏器官仍面临着一系列挑战，如支架材料相容性差，且支架材料中缺乏类似于在体的脉管结构，导致再造肝脏体积受限；此外，现有的支架材料结构和组分相对单一，尚不能为肝细胞提供与体内环境类似的微环境。正因如此，近年来，基于脱细胞基质生物材料的肝脏组织工程研究受到了越来越多的关注，发展异常迅速，并取得了一批阶段性研究成果。 脱细胞基质是指利用化学法、物理法或酶解法来破坏组织/器官中的细胞结构，并将细胞碎片从细胞外基质（extracellular matrix, ECM）中清除而获得的生物支架材料。利用不同洗脱条件处理后的脱细胞基质不仅可以保留组织或器官中的主要细胞外基质成分，而且可以使其中的血管系统及超微结构的完整性得到一定保存，因此是一种适应细胞生长和组织再生的优良材料。脱细胞技术的迅猛发展掀起了脱细胞基质的研究热潮。自从2008年Ott等人首次成功制备出心脏全器官脱细胞基质以来，研究人员已成功获得了多种脏器的全器官脱细胞基质，如肝脏、肾脏、肺脏等。肝脏作为机体最大的脏器，，基于脱细胞基质支架材料的肝脏组织工程研究已成为组织工程研究领域的焦点之一。目前，用于肝脏组织工程研究的脱细胞基质支架材料主要包括两类：非肝脏来源的脱细胞基质材料和肝脏来源的全器官脱细胞基质材料。 在基于非肝脏脱细胞基质的肝脏组织工程研究方面，为了拓宽支架材料的来源，国内外研究人员致力于探索其他组织来源的非肝脏脱细胞基质材料应用于肝脏组织工程的可行性。例如，研究人员已成功利用空肠脱细胞基质材料构建了工程化类肝组织，研究发现空肠脱细胞基质材料能够支持肝细胞正常的形态及其代谢活性，表明非肝脏来源的脱细胞基质材料能够应用于肝脏组织工程研究。目前，研究其他组织来源的脱细胞基质材料对肝细胞的支持作用或构建工程化肝脏组织已为成本领域的研究热点之一。 大网膜（greater omentum）是连接胃大弯至横结肠的腹膜，富有极强的弹性和灵活性，同时具有高度血管化的结构，这些特点使其成为组织工程和再生医学领域中优良的天然材料。目前，大网膜在临床上主要用于外科重建手术中对炎性或者缺损组织的修复，促进组织的再生；在组织工程研究领域，大网膜可作为体外移植构建物的天然生物反应器，促进构建物血管化的形成，增强移植构建物的功能，已成功应用于心肌组织工程、软骨组织工程、神经组织工程等领域。近年来，随着脱细胞技术的迅猛发展，研究人员在大网膜脱细胞基质研究中开展了大量研究工作，并成功获得了大网膜脱细胞基质支架材料，然而，目前尚未见将大网膜脱细胞基质应用于肝脏组织工程的研究报道。 在基于肝脏全器官脱细胞基质的肝脏组织工程研究方面，研究人员已经应用胎儿肝细胞、原代肝细胞、肝细胞系等多种来源的细胞接种到肝脏脱细胞基质中，成功在体外构建了具有一定功能的工程化肝脏组织或类器官。研究发现，与以往的支架材料相比，肝脏脱细胞基质能够为细胞提供更接近于天然肝脏的微环境。此外，由于细胞外基质成分在不同的物种之间具有高度保守性，脱细胞技术得到的细胞外基质支架同时具有低免疫原性的优点，因而可以作为工程化肝脏组织构建中优良的生物支架材料。 获得结构及组成均优良的肝脏脱细胞基质材料是开展基于脱细胞基质肝脏组织工程研究的基础与前提。目前，肝脏脱细胞基质制备方法主要包括物理法、化学法、酶学消化法以及上述方法的组合使用等。然而，虽然脱细胞技术的发展日新月异，涌现了许多脱细胞方法，但现有脱细胞洗脱方法均存在一定的不足，比如洗脱时间长、ECM成分破坏严重、生长因子大量丢失等。理想的制备肝脏全器官脱细胞基质的方法尚有待进一步优化。 基于上述分析，本论文主要从以下三个方面开展研究工作： 第一部分：基于大网膜脱细胞基质支架材料的肝脏组织工程研究 目的：研究大网膜脱细胞基质支架材料的成分组成、生物相容性及其应用于肝脏组织工程的可行性。方法：利用免疫组织化学染色检测四种大网膜脱细胞基质（No.1、2、3、4）的组成，通过扫描电镜检测其形态与孔径大小；在此基础上，分别接种大鼠原代分离的肝细胞构建工程化肝脏组织片层，并进行肝脏组织工程研究，不同时间点取材，通过Live/Dead染色检测细胞活性，利用HE染色、免疫组织化学染色、酶联免疫吸附测定法（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）检测工程化组织中肝细胞形态及生物学功能。结果：四种大网膜脱细胞基质均含有天然ECM中主要蛋白组分并具有典型的网状结构，其中No.1、3基质孔径较小，No.2、4基质孔径较大；肝脏组织工程研究发现，与小孔径支架材料相比，大孔径大网膜脱细胞基质支架可以更好的支持肝细胞的粘附、生长及支持其糖原储存、白蛋白分泌等生物学功能的发挥。结论：大网膜脱细胞基质作为一种优良的生物支架材料，能够维持肝细胞的形态并支持其生物学功能，在肝脏组织工程中具有良好的应用前景。 第二部分：肝脏全器官脱细胞支架材料的制备及条件优化 目的：对两种肝脏全器官脱细胞基质制备方法进行比较，以期筛选出更为有效的肝脏脱细胞基质制备方法。方法：采用两种不同方案（分别以十二烷基硫酸钠（SDS）和Triton X-100+SDS（Tx+SDS）为主要洗涤剂）制备肝脏全器官脱细胞基质，通过组织学、分子生物学等方法检测基质中细胞和核酸成分的去除情况、ECM蛋白组成及生长因子含量。结果：两种方法均能达到去细胞化要求；SDS方案得到的脱细胞基质脉管网络遭到破坏，纤维网络结构松散；Tx+SDS方案得到的脱细胞基质脉管结构完整，ECM蛋白和生长因子含量均高于SDS方案。结论：利用Tx+SDS为主要洗涤的脱细胞方法可成功制备出优良的肝脏全器官脱细胞基质，为工程化肝脏组织构建奠定了基础。 第三部分：基于肝脏全器官脱细胞支架材料的肝脏组织工程研究 目的：探索以本研究中制备的肝脏全器官脱细胞基质为支架材料，构建工程化肝脏组织的可行性。方法：以Tx+SDS方案制备肝脏脱细胞基质，接种HepG2细胞系构建工程化肝组织片层，体外培养7天后取材，利用HE染色、免疫组织化学染色、PAS染色研究工程化肝组织的形态及其生物学功能。结果：组织学染色结果表明，肝脏脱细胞基质支架可以支持细胞的粘附、生长，维持细胞形态和增殖能力；PAS染色结果显示此支架材料能够支持细胞糖原储存生物学功能的发挥。结论：Tx+SDS方法制备的肝脏全器官脱细胞支架材料具有良好的生物相容性，可维持细胞形态并支持其生物学功能，能够作为工程化肝脏组织构建的优良支架材料。 综上所述，本论文在基于非肝脏来源脱细胞基质的肝脏组织工程研究方面，系统比较了四种具有大小两类不同孔径的大网膜脱细胞基质的成分组成，发现四种大网膜脱细胞基质均良好的保留有天然ECM主要蛋白成分且具有良好的生物相容性；与小孔径支架材料相比，大孔径大网膜脱细胞基质能够更好的维持肝细胞形态并支持其糖原储存、白蛋白分泌等生物学功能的发挥，证实了大网膜脱细胞基质应用于肝脏组织工程的可行性，拓展了肝脏组织工程中脱细胞基质支架材料的来源。在基于肝脏全器官脱细胞基质的肝脏组织工程研究方面，本论文首先比较研究了两种制备肝脏全器官脱细胞基质的洗脱方案，研究发现与SDS方案相比，Tx+SDS洗脱方案制备的肝脏脱细胞基质可以保留天然肝脏的三维网络结构、脉管结构完整性，并能更好的保留ECM基本组分。其次，以Tx+SDS洗脱方案制备的肝脏脱细胞基质为支架材料构建工程化肝脏组织，发现工程化组织中细胞能够维持良好的形态并能够发挥生物学功能，表明以Tx+SDS洗脱方案制备的肝脏脱细胞基质具有良好的生物学性能，能够作为工程化肝脏组织构建优良的支架材料。上述基于脱细胞基质支架材料的肝脏组织工程研究有望为肝衰竭未来的临床治疗提供新的策略与手段。

  本文关键词：基于脱细胞基质支架材料的肝脏组织工程研究，由笔耕文化传播整理发布。