ERMC在内毒素急性肺损伤中的作用及机制

发布时间：2020-03-24 01:33

【摘要】：研究目的:既往我们的研究发现,内毒素急性肺损伤过程中存在着细胞器功能障碍,包括线粒体功能障碍、内质网应激等。而作为内质网和线粒体之间的重要结构,ERMC是多种疾病发生发展的重要作用因素,但内毒素急性肺损伤过程中是否存在ERMC异常并不清楚。为此,本课题主要探讨ERMC在内毒素急性肺损伤发病机制中的作用。研究方法:为了验证ERMC在内毒素急性肺损伤中的作用和筛选其中发挥主要作用的蛋白分子,我们从动物模型和细胞模型两个水平进行评估,具体分为以下三个部分:第一部分主要构建内毒素急性肺损伤小鼠模型。首先我们分别比较BALB/c和C57BL/6两种小鼠在接受不同剂量LPS(5、10和20mg/kg)尾静脉注射后12小时内两种小鼠的生存率情况和肺组织损伤情况;另外,我们又观察了不同给药途径对BALB/c小鼠生存率的影响。通过分析上述结果我们将C57BL/6小鼠作为构建内毒素急性肺损伤的研究对象。C57BL/6小鼠尾静脉注射LPS 15mg/kg,对照组小鼠予以等体积的生理盐水作为对照,分别于LPS注射后1、4、8和12小时四个不同时点,观察肺组织损伤评分、W/D、BALF中白蛋白含量、BALF和血清中TNF-α、IL-6、MDA含量和SOD活性的变化,通过比较上述不同时点的变化情况,我们来确定LPS作用于小鼠的最佳时点。第二部分主要观察内毒素急性肺损伤引起的ERMC的变化。通过透射电镜观察内毒素急性肺损伤小鼠肺组织内ERMC的变化,并比较ERMC组成分子的表达变化,从而筛选异常表达的蛋白分子;此外,通过检测线粒体内Ca~(2+)和ROS的变化、线粒体膜电位及线粒体RCR的变化以此反映ERMC异常所引起的功能改变。第三部分通过siRNA下调IP3R-1的表达水平,观察其能否改善内毒素攻击细胞模型中线粒体功能及抑制ERMC形成,主要指标与动物实验相同;除外之外,我们又检测了线粒体途径细胞凋亡相关蛋白的表达水平。研究结果:通过实验一我们发现,在相同LPS作用下,BALB/c小鼠12小时生存率均低于C57BL/6小鼠,差异均具有统计学意义,但两种小鼠肺组织损伤程度相当;不同LPS给药途径对BALB/c小鼠的12小时生存率无明显影响,由此我们确立了C57BL/6小鼠为构建内毒素急性肺损伤的实验动物。随后,通过比较尾静脉注射15mg/kg LPS后不同时点各指标的变化,我们发现LPS注射12h后肺组织损伤半定量评分最高,W/D和BALF中白蛋白最高,血清和BALF中TNF-α、IL-6和MDA水平最高,SOD活性最低。由此我们确定了内毒素急性肺损伤模型中LPS给药剂量为15mg/kg,作用时间为12h。由实验二我们发现,内毒素急性肺损伤小鼠肺组织细胞内ERMC形成增多,线粒体明显肿胀、空泡化,单个视野内线粒体数目减少而横截面积显著增加;肺组织匀浆中和ERMC中IP3R-1的表达水平明显上调,Mfn-2的表达显著下调,而其他ERMC组成分子如IP3R-2、PACS-2和Sig-1R表达无明显变化;此外,线粒体功能学实验发现,线粒体RCR和线粒体膜电位明显降低,线粒体内Ca~(2+)含量和ROS含量升高明显,差异均显著。在实验三中,我们发现内毒素攻击细胞模型中细胞内同样表现出线粒体肿胀、空泡化和线粒体嵴消失,ERMC形成增加,线粒体功能异常;而通过siRNA基因沉默IP3R-1能够使内毒素攻击细胞模型内线粒体肿胀程度减轻,ERMC形成显著减低,提高线粒体膜电位和线粒体RCR水平,降低线粒体Ca~(2+)浓度,减少线粒体内ROS的生成量,IP3R-1表达降低能够明显下调内毒素攻击细胞模型细胞内Caspase-9、Caspase-3和Bax等与线粒体途径细胞凋亡相关蛋白的表达水平,显著上调Bcl-2的表达水平。研究结论:在内毒素急性肺损伤过程中,小鼠肺组织细胞内ERMC形成增加,且参与Ca~(2+)转运的IP3R-1的表达明显上调,进而导致线粒体内钙超载,进而导致线粒体功能异常,而下调细胞内IP3R-1的表达水平能够抑制内毒素攻击细胞模型中细胞内ERMC的形成,从而改善线粒体功能,抑制细胞凋亡,发挥细胞保护作用,而Mfn-2在内毒素急性肺损伤中ERMC中作用仍不明确,需要进一步研究。
【图文】：

绗宦畚?图 1、内质网线粒体结构偶联（ERMC）结构模式图1、ERMC 异常可引起线粒体钙超载，导致线粒体功能障碍正常生理情况下，Ca2+主要储存在内质网中，当兴奋时释放到胞浆中形成钙信号，引起广泛的生理效应[35]。线粒体能够摄取并储存少量 Ca2+，Ca2+通过影响线粒体氧化呼吸链中几类脱氢酶调节线粒体自身的代谢状态[36]。研究发现，Ca2+在一定浓度内可以促进三磷酸腺苷（Adenosine triphosphate，ATP）合成，由 IP3R 介导释放的 Ca2+参与线粒体能量代谢，如果敲除细胞 IP3R

天津医科大学博士学位论文方便肺泡支气管灌洗，将小鼠旋转 180°，使小鼠的头部分游离。8#静脉留置针插入气管内，用 2-0 丝线结扎固定。ml 注射器吸取 500 μl PBS 缓冲液，抽取 500μl 空气，将推注到气管内，小心反复抽取 3 次，将收集到的 BAL述收集好的 BALF 在 4℃、500 g 下离心 5 min，收集上白蛋白的含量。
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R563.8

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本文编号：2597587