三维培养对hAMSC创面修复相关因子表达的影响研究

发布时间：2020-04-15 16:26

【摘要】：目的:对比研究人羊膜间充质干细胞(Human amniotic mesenchymal stem cells,hAMSCs)在普通二维培养与水凝胶三维培养条件下创面修复相关因子的表达变化,为进一步以水凝胶为载体的hAMSCs局部移植促进创面愈合的临床转化研究提供前期的资料。方法:采用机械法联合酶消化法分离提取hAMSCs并在普通二维条件下培养,取第三代生长良好的细胞,应用流式细胞学(FCM)技术,三系(成脂、成骨、成软骨)诱导分化,波形蛋白(vimentin)免疫荧光染色对分离的细胞进行鉴定。将上述生长良好的第三代hAMSCs用无血清培养基制作细胞悬液后与ShakeGel ~TMM 3D水凝胶混合(体积比1:1)进行三维培养,培养7天后与普通二维培养条件下的hAMSCs进行如下指标检测并进行对比:(1)倒置相差显微镜观察两种培养条件下细胞形态及生长情况;(2)波形蛋白免疫荧光染色;(3)激光共聚焦显微镜观察Live/Dead染色鉴定细胞活力;(4)水凝胶中三维培养的hAMSCs采用激光共聚焦显微镜观察诱导分化后的脂肪生成的主要调节因子过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptorγ,PPAR-γ)、成骨细胞分泌的骨钙蛋白(osteocalcin,OCN)、成软骨细胞的关键转录因子SOX9标记物及鬼笔环肽的免疫荧光染色以检测其诱导分化情况;(5)收集两种培养条件下的hAMSCs,提取RNA并应用RT-qPCR技术测定其创面修复相关因子mRNA相对表达量;(6)收集两种培养条件下的细胞培养上清液,应用ELISA技术测定创面修复相关因子蛋白表达量。结果:(1)二维培养的第三代hAMSCs镜下呈长梭形旋涡状生长的典型间充质样细胞形态,呈扁平纺锤状紧贴细胞培养瓶瓶壁生长;流式细胞术鉴定hAMSCs高表达CD44、CD73、CD90、CD105,不表达或低表达CD34、CD19、CD45、CD11b、HLA-DR;波形蛋白阳性表达;分别进行三系诱导分化后,茜素红染色显示成骨诱导后细胞存在矿化结节,油红O染色显示成脂诱导后细胞质内可见脂滴聚集,甲苯胺蓝染色显示成软骨诱导后细胞基质中分泌大量的糖胺聚糖。(2)在水凝胶中三维培养的hAMSCs镜下可见细胞均匀、多层分散于水凝胶中,呈立体圆形透亮状,在×400镜下可见细胞向四周稍伸出伪足;波形蛋白荧光染色呈阳性,在细胞中呈立体圆形均匀分布;Live/Dead染色见水凝胶中细胞活性好,提示水凝胶对细胞无毒性;三系诱导分化后成脂(PPAR?)、成骨(OCN)、成软骨(SOX9)特异性分化标记物的免疫荧光染色均为阳性结果,提示其仍然具有诱导分化潜能,但鬼笔环肽对细胞骨架进行染色发现,细胞的形态未发生明显改变,提示其分化潜能可能有所下降。(3)在水凝胶中三维培养后的hAMSCs较二维培养的hAMSCs创面修复相关因子IL-6、IL-8、HGF、EGF、bFGF、VEGF、HA、Vimintin的mRNA相对表达量增加,且差异均有统计学意义(P0.05),IL-4、IL-10、TIMP、MMP、TGF-β1、KGF的表达较二维培养的hAMSCs的mRNA表达升高,统计学分析两者差异无统计学意义(P0.05);(4)在水凝胶中三维培养的hAMSCs的上清液较二维培养的hAMSCs的上清液中IL-6、IL-8、IL-10、HGF、EGF、bFGF、KGF、VEGF的蛋白表达量增加,且差异有统计学意义(P0.05),IL-4、TIMP、MMP、TGF-β1的蛋白含量较二维培养的hAMSCs上清液表达升高,统计学分析两者差异无统计学意义(P0.05)。结论:水凝胶作为hAMSCs的三维培养支架及细胞生长的微环境,生物相容性很好,可能使细胞的形态以及创面修复相关因子的旁分泌生物学效应能够被更好的呈现,是良好的hAMSCs载体,为进一步进行临床转化研究提供了部分前期研究资料。
【图文】：

二维培养的hAMSCsP2代第3天（放大倍率×40）

遵义医科大学硕士学位论文 杨晓双CD44（96.23%）、CD73（99.54%）、CD90（96.88%）、CD105（98.58%）；CD34、CD11b、CD19、CD45、HLA-DR均呈阴性表达，，符合国际细胞治疗协会间充质干细胞表面标记物的规定。2.2 二维培养的 hAMSCs 波形蛋白免疫荧光染色二维培养的 hAMSCs 经免疫荧光染色后可见波形蛋白表达，说明培养的细胞为间充质来源细胞，绿色荧光呈扁平纺锤状紧贴细胞培养瓶瓶壁（图 2）。
【学位授予单位】：遵义医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R641

【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 韦林;简珊;;皮肤软组织扩张器在创面修复中的应用体会[J];中国美容医学;2007年10期

2 李凤玉;杨红明;柴家科;;成纤维细胞在创面修复中的的生物学行为及其调控因素[J];军医进修学院学报;2006年05期

3 ;2003创面修复和瘢痕防治学术研讨会征文通知[J];中华外科杂志;2002年12期

4 ;创面修复和瘢痕防治学术研讨会征文通知[J];中华医学杂志;2002年10期

5 ;创面修复和瘢痕防治学术研讨会征文通知[J];中华医学杂志;2002年13期

6 付小兵;盛志勇;;进一步重视创面修复研究[J];中华整形烧伤外科杂志;1999年03期

7 刘远达;对61例上肢创面修复的体会[J];修复重建外科杂志;1988年02期

8 徐庆连;李兴照;;创面修复的一些思考[J];中华损伤与修复杂志(电子版);2018年02期

9 邹元明;;深度烧伤创面早期处理及促进创面修复分析[J];中国医疗美容;2015年03期

10 蔡学海;黄楚浩;;硅基创面修复材料对临床各种创口愈合的影响分析[J];中国实用医药;2014年14期

相关会议论文 前10条

1 张玮;姜笃银;钱春华;汤淳;;复杂创面修复中应用负压封闭引流技术的探讨[A];中华医学会急诊医学分会第17次全国急诊医学学术年会论文集[C];2014年

2 陆树良;;集成创新推进创面修复专科的内涵建设[A];第四届长三角地区创伤学术大会暨2014年浙江省创伤学术年会论文汇编[C];2014年

3 方勇;傅秀军;;创面修复的研究进展[A];中华医学会烧伤外科学分会2009年学术年会论文汇编[C];2009年

4 于家傲;;灾难性损伤创面修复方案的选择[A];急、慢性创面治疗新技术专题系列研讨会之灾难性成批伤早期救治与创面修复论坛论文汇编[C];2010年

5 黄跃生;;促进创面修复的重要相关因素和措施研究[A];第八届全国烧伤外科学年会论文汇编[C];2007年

6 丁若虹;韩斌;陈正华;谢正华;翁志勇;汤俊;柯发军;黄晓明;;功能部位深度烧伤创面修复体会[A];中华医学会烧伤外科学分会2009年学术年会论文汇编[C];2009年

7 孙慧勤;杨涛;邹仲敏;郝娜;王涛;王钰;王锋超;周青;高鹏;冉新泽;粟永萍;;不同功率的微波辐射对创面修复细胞的作用[A];第九届全国生物医学体视学学术会议、第十二届全军军事病理学学术会议、第八届全军定量病理学学术会议论文汇编[C];2014年

8 黄跃生;;促进创面修复的重要相关因素和措施研究进展[A];中华医学会烧伤外科学分会2009年学术年会论文汇编[C];2009年

9 杨蔚;许瑾;;股前外侧筋膜(皮)瓣在Ⅳ度烧伤创面修复中的临床应用[A];中华医学会烧伤外科学分会2009年学术年会论文汇编[C];2009年

10 金汉宏;郑国平;;优拓对创面修复作用的临床观察32例[A];中华医学会第六届全国烧伤外科学术会议论文汇编[C];2001年

相关重要报纸文章 前8条

1 四川省广元市第三人民医院 郭忠 周正华;创面修复与功能重建是关键[N];健康报;2018年

2 首席记者 唐闻佳 通讯员 丁燕敏;瑞金医院首开创面修复专病门诊[N];文汇报;2017年

3 张献怀;慢性难愈合创面修复科研课题成果丰[N];中国医药报;2002年

4 中国工程院院士 付小兵;创面修复可人为提速[N];健康报;2013年

5 ;细胞活能在创面修复上的应用[N];中国质量报;2003年

6 记者 唐闻佳 通讯员 章米力;沪成立创面修复研究中心[N];文汇报;2012年

7 本报记者 赵若言 董世梅;不同的熬法 怎样“熬”出高端中药[N];四川日报;2014年

8 南方日报记者 魏方　实习生 谭璇璇 杨柳 通讯员 郝黎;“移花接木”的高手 做起手术“蛮拼的”[N];南方日报;2015年

相关博士学位论文 前8条

1 高文东;基于难愈创面修复的生物活性支架制备及机理研究[D];华南理工大学;2018年

2 于殿君;维甲酸信号通路在前列腺铥激光切除术后创面修复中的作用和机制探讨[D];南京医科大学;2018年

3 有传刚;含纳米银的胶原—壳聚糖多孔支架的促进创面修复作用研究[D];浙江大学;2014年

4 林才;溶胶—凝胶生物活性玻璃对糖尿病难愈创面修复机理研究[D];华南理工大学;2014年

5 赵穆欣;自体口腔黏膜微粒移植修复创面的实验研究及在阴道再造术中的临床应用[D];中国协和医科大学;2009年

6 周武;封装VEGF及bFGF的海藻酸钠凝胶负荷内皮祖细胞修复大鼠皮肤创面的实验研究[D];华中科技大学;2015年

7 寿康全;诱导间充质干细胞分化促进创面修复的实验研究[D];武汉大学;2017年

8 柴政;一效膏促进慢性皮肤溃疡创面修复的研究[D];辽宁中医药大学;2016年

相关硕士学位论文 前10条

1 杨晓双;三维培养对hAMSC创面修复相关因子表达的影响研究[D];遵义医科大学;2019年

2 陈国璞;仿生多功能复合水凝胶促进创面修复的应用基础研究[D];南京大学;2019年

3 孙璐瑶;纳米纤维基难愈创面修复材料的仿生构建及研究[D];华南理工大学;2018年

4 沈胡刚;黄芩油膏在增生性瘢痕点阵二氧化碳激光治疗后创面修复的疗效评价[D];南京中医药大学;2017年

5 何秀叶;PRX-2基因对成人表皮干细胞增殖的调控及其对创面修复影响的研究[D];中国人民解放军医学院;2017年

6 吴文勋;负压封闭引流技术在深部创面修复中的应用[D];广西医科大学;2012年

7 费冀;中药石香膏促进慢性难愈合创面修复临床观察[D];贵阳中医学院;2015年

8 潘斯俭;慢性缺血性创面修复过程中细胞凋亡和增殖调控的实验研究[D];昆明医学院;2005年

9 韩兆峰;严重烧伤全身与局部微量元素含量变化特点及对创面修复的机理探讨[D];南方医科大学;2008年

10 寇列玲;自体角膜缘干细胞移植术联合中药治疗翼状胬肉的临床研究[D];陕西中医药大学;2015年

本文编号：2628746