内质网应激在颅脑创伤中作用机制的研究

发布时间：2020-04-17 17:25

【摘要】：研究目的:创伤性脑损伤(Traumatic brain injury,TBI)是人类21世纪致死致残的重要因素,其主要机制与脑创伤后的神经元凋亡以及炎症反应关系密切。相关研究发现内质网应激在细胞凋亡以及免疫炎症反应中发挥重要作用,但其与颅脑创伤的关系尚不明确。本课题组将在既往研究的基础上探索颅脑创伤小鼠内质网应激的变化规律,并通过牛磺熊去氧胆酸(TUDCA)阻断颅脑创伤后内质网应激,进一步探索内质网应激在颅脑创伤后神经元凋亡、免疫炎症反应以及血脑屏障破坏中的作用,为颅脑创伤提供新的治疗靶点和理论依据。方法:1.通过采用电控脑挫伤打击仪(eCCI)制作小鼠脑创伤模型。成年雄性C57/BL6小鼠被随机分为假手术组(Sham组)和颅脑创伤组(TBI组)。TBI组小鼠又根据不同的处死取材时间分为颅脑创伤后12h、1D、3D、7D组。通过Western Blot技术和免疫荧光技术检测TBI小鼠不同时间脑组织内质网应激相关标记物GRP78的变化规律。2.为了探索内质网应激在颅脑创伤中的作用,我们通过腹腔注射TUDCA(500mg/kg)阻断TBI小鼠的内质网应激,将实验动物分为假手术组(Sham组),颅脑创伤组(TBI组)以及颅脑创伤+TUDCA(TBI+TUDCA组)。应用Western Blot检测p-PERK,PERK,p-eIF2a,eIF2a,ATF4的表达水平,评估TUDCA对TBI小鼠内质网应激的抑制作用;通过改良的神经功能学评分(mNSS评分)以及平衡木实验(Beam Balance实验)评估内质网应激与TBI小鼠神经功能恢复之间的关系;应用干湿重法评估TBI小鼠的脑组织水肿情况,通过伊文思蓝渗漏(Evans Blue渗漏)法评估TBI小鼠血脑屏障的破坏程度,通过Western Blot技术检测紧密连接蛋白ZO-1,Claudin5的表达水平,探索内质网应激与TBI后血脑屏障破坏的的关系;应用免疫荧光技术和ELISA试剂盒检测TBI后小胶质细胞的激活情况以及IL-1β、TNFα、IL-6等炎症因子释放情况,探索内质网应激与TBI后免疫炎症反应的关系;应用TUNEL试剂盒检测TBI小鼠神经元的凋亡情况以及应用Western Blot技术和免疫荧光技术检测TBI小鼠脑组织内质网应激相关性细胞凋亡蛋白Chop以及Caspase-12在神经元中的表达情况,探讨内质网应激与TBI后神经元细胞凋亡之间的关系。3.为了探索TUDCA的神经保护作用机制,我们首先通过Western Blot技术检测颅脑创伤组小鼠TBI后12h、1D、3D、7D的Akt蛋白的变化规律。给予小鼠注射TUDCA后检测不同组别小鼠脑组织Pten、p-Akt、Akt、Bax、Bcl-2的表达水平,探索TUDCA与Akt信号通路及其下游凋亡相关蛋白的关系。随后我们通过给予TBI小鼠口服MK2206(60 mg/kg)以及侧脑室注射siRNA-Akt来阻断Akt基因的表达,通过应用改良的神经功能学评分(mNSS评分)以及平衡木实验(Beam balance实验)检测Akt信号通路被阻断后TBI小鼠的神经功能恢复情况,通过应用Western Blot技术和qRT-PCR技术检测Grp78,p-eIF2a,eIF2a,Bcl-2,Bax,CHOP,p-Akt,Akt,Pten以及Caspase-12的表达水平,进一步探索TUDCA发挥神经保护作用的机制。结果:1.(1)TBI后,脑组织内质网应激标记物Grp78的表达水平从12h起开始逐渐升高,并在TBI后3D达到高峰。(2)与Sham组相比,TBI小鼠脑组织神经元中CHOP的表达水平也有显著增加。2.(1)TUDCA可有效阻断PERK-ATF4-CHOP信号通路的激活,有效抑制TBI后内质网应激水平。(2)阻断内质网应激可显著改善TBI小鼠的神经功能预后。(3)阻断内质网应激可以明显缓解TBI小鼠的脑组织水肿,减轻血脑屏障渗漏,促进TBI小鼠的血脑屏障修复。(4)阻断内质网应激可明显降低内质网应激相关性细胞凋亡蛋白在神经元中的表达,减少神经元凋亡。(5)阻断内质网应激可有效减少TBI后小胶质细胞的过度激活以及炎症因子的释放,缓解免疫炎症反应。3.(1)p-Akt的表达水平则从TBI后12h开始逐渐降低,并在TBI后的3D达到最低。(2)TUDCA可以在抑制Pten基因的表达的同时促进Akt信号通路的激活,并通过调控下游凋亡蛋白的表达缓解TBI引发的脑组织神经细胞凋亡。(3)MK2206(60 mg/kg)以及siRNA-Akt均可以显著抑制TUDCA对TBI小鼠的神经保护作用,进一步验证TUDCA的保护作用是通过激活Akt信号通路来实现的。结论:1.TBI可引发内质网应激,促进内质网应激相关性细胞凋亡蛋白在神经元中的表达,且于伤后第3天达到高峰。2.阻断内质网应激可有效促进TBI小鼠的血脑屏障修复,促进血管新生,减少血脑屏障渗漏。3.阻断内质网应激可有效缓解TBI小鼠的炎症反应,减少神经元凋亡,改善TBI小鼠预后。4.TUDCA可有效阻断Pten基因的表达,并促进Akt信号通路的激活,通过调控下游Bax、Bcl-2等基因的表达改善TBI小鼠预后。5.Akt抑制剂可明显阻断TUDCA的神经保护作用,提示TUDCA的神经保护作用依赖Akt信号通路的激活来实现。
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R651.15

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本文编号：2631109