SVF-gel促进糖尿病鼠慢性创面愈合的实验研究

发布时间：2020-04-18 02:16

【摘要】：研究背景和目的:慢性创面是临床治疗颇为棘手的疾病,常见于与糖尿病足、静脉性溃疡、褥疮及深度创伤等疾病。目前,临床上针对慢性创面仍缺乏有效的治疗方法,其修复难点在于新生血管较正常创面少,创面局部血液供应不足,炎症因素持续存在等。随着干细胞技术的不断突破,ADSCs因较其它成体干细胞更易获取、储量丰富、并发症小、较少涉及伦理问题,再次注射后可以分泌多种促进血管新生生长因子,被认为是目前最适宜的创面修复干细胞。然而一方面直接将干细胞注射到病变部位,细胞存活率较低。其次SVF/ADSCs的制备过程较复杂,耗时耗力耗财,临床上广泛使用可行性不强。再者SVF/ADSCs提取过程中添加的胶原酶及培养过程中添加的异种血清都可能对ADSCs造成污染,引起机体免疫排斥反应。因此,寻找到一种高效、经济、安全的方法在临床治疗研究领域处理以上问题显得尤为重要。SVF-gel是一脂肪细胞破坏,并经过高速离心析出大量的油脂,得到富含有脂肪干细胞和细胞外基质(ECM)的复合物。ECM可以为ADSCs提供细胞外支架,保护脂肪干细胞免遭巨噬细胞的吞噬,使其能更好的发挥再生能力。于是我们猜测SVF-gel相比与单纯的SVF悬液,有更佳的促进创面愈合的效果。本课题拟将SVF-gel局部移植到慢性创面模型,来观察和评估其对慢性创面治疗的效果。方法:首先制备SVF-gel模型,并对其是否含有脂肪干细胞进行验证。其次,我们建立糖尿病鼠慢性创面模型,同时将SVF-gel和SVF悬液局部移植到大鼠的创面上,拍照观察创面愈合情况并计算出每组各个时间点的创面愈合率。收集标本,进行HE染色,观察各组创面组织病理学状况,免疫组织化学染色计算各组创面新生血管的数量。western blotting分别检测各组糖尿病大鼠第14d创面肉芽组织中VEGF蛋白表达情况。进一步探究SVF-gel促进创面再生的可能机制。结果:1.成功制备的SVF-gel是一种类似透明质酸凝胶状的物质,10ml的结构脂肪可以得到大约1ml的SVF-gel,对SVF-gel进行体外培养,可以成功的培养出脂肪干细胞,并且这些脂肪干细胞仍具有成脂、成骨、成软骨的多向分化的能力。2.创面愈合率比较:SVF-gel组在3d、7d、10d、14d的创面愈合率明显优于其他两组。说明SVF-gel对慢性创面有更佳的促愈合效果。3.HE染色结果:第14d,对照组创面内有大量炎症细胞浸润和成纤维细胞,细胞排列紊,新生血管少,肉芽组织结构疏松,再上皮化不完整。SVF-gel组与SVF悬液组相比,炎症细胞浸润减少,真皮毛细血管数量明显增多,再上皮化程度明显,肉芽组织结构致密。SVF悬液组与对照组相比,炎症细胞浸润减少,较多的胶原纤维及毛细血管,再上皮化较完整,但不及SVF_gel组。4.免疫组织化学染色结果:治疗后10d,3组创面肉芽组织内均有垂直于创面的新血管生成。SVF-gel、SVF悬液两组新生血管数量多于生理盐水对照组,部分新生血管尚无明显的管腔结构,血管断层仅有单个内皮细胞。14d后,创面内血管的数量均较10d明显增加。SVF-gel组、SVF悬液组创面内均可见较多具有成熟管腔的新生血管,而生理盐水组较少。5.western blotting检测10d各组创面组织内VEGF蛋白的表达情况:SVF-gel组VEGF蛋白表达较SVF悬液组、对照组明显增多,差异有统计学意义(p0.05),VEGF蛋白在SVF悬液的表达量也明显高于对照组,差异具有统计学意义(P0.05)结论:SVF-gel是一种新型的脂肪来源可注射产物,使用简单的物理方法便可从脂肪抽吸物中获得高度浓缩的脂肪干细胞和近似生理状态下的细胞外基质(ECM)。我们将SVF-gel应用到大鼠的慢性创面中,与单纯的SVF悬液相比,其有更佳的促进创面愈合的效果。主要是通过分泌更多VEGF,诱导慢性创面中新生血管的形成,同时其也可调控难愈合创面内炎症反应,加速再上皮化的形成。
【图文】：

脂肪变,脂肪,透明质,乳糜

gel 的实物获取结果man 脂肪在两个注射器之间来回的对推，先变成乳糜状的纳t），，然后经过高速离心后析出大量的油脂，变成了类似透明质质即 SVF-gel。10ml 的结构脂肪大约可得到 1ml 的 SVF-gel。如下Coleman 脂肪 Nanofat

三系,分离培养

3.2 SVF-gel 的细胞体外培养刚从 SVF-gel 分离培养的干细胞成透明的圆滴状，漂浮在培养基中。2细胞大多数能完全贴壁，变成菱形或者多角形。如图 1-2：贴壁的 ADSCs（200×）图 1-23.3 SVF-gel 中提取的原代 ADSC 三系分化的结果将从 SVF-gel 分离培养的细胞，进行成脂、成骨、成软骨三系诱导分下图为 ADSCs 三系分化的结果：
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R587.2;R641

【参考文献】