HMGB1在滇重楼治疗脓毒症所致肠道功能障碍中的表达研究

发布时间：2020-05-02 19:22

【摘要】：第一部分滇重楼总皂苷对LPS刺激离体肠上皮屏障功能障碍的影响[目的]脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)刺激人结肠腺癌Caco-2细胞肠上皮单层细胞模型,给予滇重楼总皂苷(Rhizoma Paridis of yunnan of total saponin,RPTS)干预,并用晚期炎症因子高迁移族蛋白B1(Highmobility group proteinB1,HMGB1)的抑制剂丙酮酸乙酯(Ethyl pyruvate,EP)进行对照,观察RPTS对LPS诱导离体肠上皮屏障功能障碍及HMGB1释放的影响。[方法]将人结肠腺癌Caco-2细胞按5× 1 05个/ml接种于Transwell小室上室(500μl/孔)构建肠上皮单层细胞模型,随机分为5组(n=12孔/组):空白对照组(Control组)、模型组(LPS组)、滇重楼总皂苷治疗组(RPTS+LPS组)、滇重楼总皂苷组(RPTS组)、治疗对照组(EP+LPS组)。采用跨上皮电阻仪定期测定跨上皮电阻值(Transepithelial electrical resistance,TEER值),当TEER值500 Ω·cm2时肠上皮单层细胞模型构建成功,给予各组不同处理,LPS 组、RPTS+LPS 组、EP+LPS 组给予 LPS100 μg/ml,RPTS+LPS 组、RPTS.组给予RPTS1μg/ml,EP+LPS组给予EP50μg/ml。分别于处理后0、6、12、24h测定TEER值,于处理后24h测定异硫氰酸荧光素(FITC)-右旋糖酐通透率(Permeability coefficient of FITC,PF),于处理后 6、12、24 h 应用 RT-PCR和Western-blot测定HMGB1 mRNA和蛋白表达水平。[结果]①倒置显微镜观察可见,LPS组细胞数目显著减少,分布不均匀,细胞形态不规则,折光性减弱,部分区域有缺失空洞形成,沿孔洞边缘有片状单层细胞飘起,培养液浑浊,漂浮细胞多。RPTS+LPS组较LPS组细胞数量多,形态较规则,漂浮细胞较少,折光性较好,培养液较清。RPTS组、EP+LPS组与Control组无明显差异。②检测TEER值发现,与Control组比较,LPS组6h、12h、24hTEER值均降低,差异均有统计学意义(均P0.05),24h时下降超过OhTEER值的一半。与 LPS 组比较,RPTS+LPS 组、RPTS 组及 EP+LPS 组 6h、12h、24h TEER值均升高,差异均有统计学意义(均P0.05)。③检测FITC-右旋糖酐通透率PF发现,与Control组比较,LPS组24hPF显著升高,差异显著有统计学意义(P0.005)。与 LPS 组比较,RPTS+LPS 组、RPTS 组及 EP+LPS 组 24hPF均降低,差异均有统计学意义(均P0.05)。④检测Caco-2细胞HMGB1mRNA和蛋白表达水平发现,与Contro1组比较,LPS组6h、12h、24hHMGB1mRNA和蛋白表达水平均显著升高,差异显著均有统计学意义(均P0.005)。与LPS组比较,RPTS+LPS 组、RPTS 组及 EP+LPS 组 6h、12h、24h HMGB1 mRNA 和蛋白表达水平均显著降低,差异显著均有统计学意义(均P0.005)。⑤LPS组.各时间段(6h、12h、24h)晚期炎症因子HMGB1蛋白表达水平与TEER值呈显著负相关,差异显著均有统计学意义(均P0.005)。[结论]体外实验表明,滇重楼总皂苷可能通过下调Caco-2细胞晚期炎症因子HMGB1表达,改善肠上皮屏障通透性和完整度,抑制肠上皮屏障功能障碍进展,从而起到肠道功能保护作用。第二部分滇重楼灌胃对脓毒症大鼠肠道功能障碍及小肠HMGB1表达的影响[目的]脂多糖(LPS)诱导脓毒症(sepsis)大鼠肠道功能障碍,给予不同浓度滇重楼(RhizomaParidisofyunnan,RP)灌胃,探讨滇重楼灌胃对脓毒症大鼠肠道功能障碍及小肠高迁移率族蛋白B1(HMGB1)表达的影响。[方法]清洁级成年SD大鼠150只,雌雄各半,随机分为5组(n=30只/组),分别为对照组、模型组、滇重楼低剂量组(滇重楼20mg/kg.po)、滇重楼中剂量组(滇重楼40mg/kg.po)、滇重楼高剂量组(滇重楼80mg/kg.po)。构建脓毒症大鼠模型(LPS1mg/kg.iv),给予各组不同处理,滇重楼低、中、高剂量治疗组分别予以滇重楼20mg/kg、40mg/kg、80mg/kg灌胃,对照组和模型组予以等量生理盐水灌胃,连续观察大鼠行为学变化及死亡率。于灌胃治疗后7d,取动脉血检测血中白细胞数(WBC)、谷丙转氨酶(ALT)、肌酸激酶同工酶MB(CK-MB)、肌酐(Cre)、乳酸(Lac)的含量。分别于灌胃治疗后1d、3d、7d、14d,行小肠推进率检测,并取小肠行HE染色及病理组织学评分,采用ELISA法检测小肠中HMGB1蛋白表达水平;同时,取血浆用ELISA法检测血浆二胺氧化酶(Double amine oxidase,DAO)活性。[结果]①与对照组比较,模型组大鼠死亡率和小肠推进率均升高,滇重楼低、中、高剂量组小肠推进率均降低,差异均有统计学意义(均P0.05)。与模型组比较,滇重楼低、中、高剂量组大鼠死亡率和小肠推进率均降低,差异均有统计学意义(均P0.05)。②于治疗后7d检测大鼠血液指标发现,与对照组比较,模型组大鼠全血中ALT、CK-MB、Cre含量升高,WBC含量均下降,差异均有统计学意义(均P0.05);Lac含量稍有升高,但差异无统计学意义(P0.05)。与模型组比较,滇重楼低、中、高剂量组全血中ALT、CK-MB、Cre含量均下降,WBC含量升高,差异均有统计学意义(均P0.05);Lac稍有降低,但差异均无统计学意义(均P0.05)。③根据HE染色结果进行病理组织学评分,与对照组比较,模型组病理组织学评分Ⅲ级百分比显著升高,差异显著有统计学意义(P0.005)。与模型组比较,滇重楼低、中、高剂量组病理组织学评分Ⅲ级百分比均显著下降,差异显著均有统计学意义(均P0.005)。④不同处理后1d、3d、7d、14d,与对照组比较,模型组1d、3d、7d、14d血浆DAO活性和小肠HMGB1蛋白表达水平均升高,差异均有统计学意义(均P0.05)。与模型组比较,滇重楼低、中、高剂量组1d、3d血浆DAO活性和小肠HMGB1蛋白表达水平均稍有下降,但差异均无统计学意义(均P0.05);滇重楼低、中、高剂量组7d、14d血浆DAO活性和小肠HMGB1蛋白表达水平均下降,差异均有统计学意义(均P0.05)。⑤模型组各时间段(1d、3d、7d、14d)小肠HMGB1蛋白表达水平与血浆DAO活性呈显著正相关(均P0.005)。[结论]体内实验表明,滇重楼灌胃可能通过抑制HMGB1表达参与抗炎反应,改善小肠粘膜屏障通透性,抑制肠道功能障碍,从而发挥肠道功能保护作用。
【图文】：

重楼,皂苷,薯蓣皂苷,化学结构式

进小鼠粒／巨噬细胞克隆形成细胞（ＧＭ－ＣＦＣ）活化，增强细胞吞噻能力［２５］。Ｐ－逡逑蜕皮激素、鞣质、叶多糖（ＰＰＬＰｓ）也具有抑菌及免疫调节活性。此外，滇重楼逡逑内生真菌可诱导生成万古霉素衍生物，直接参与抗炎反应［２６］；重楼还可刺激糖皮逡逑质激素分泌，通过下丘脑－垂体－肾上腺轴（ＨＰＡ）间接参与抗炎反应［２７］。逦■—逡逑因此，本研宄拟通过ＬＰＳ刺激人结肠腺癌Ｃａｃｏ－２细胞单层上皮模型模拟离逡逑体肠上皮屏障功能障碍，并通过运用滇重楼总阜苷（Ｒｈｉｚｏｍａ邋Ｐａｒｉｄｉｓ邋ｔｏｔａｌ逡逑ｓａｐｏｎｉｎｓ，ＲＰＴＳ）进行干预，采用Ｗｅｓｔｅｍｂｌｏｔ、ＲＴ－ＰＣＲ、跨上皮电阻测定等技逡逑术探讨ＬＰＳ诱导下的肠上皮细胞中ＨＭＧＢ１的表达规律。明确滇重楼总皂苷在逡逑ＬＰＳ刺激离体肠上皮屏障功能障碍中的作用机制及对晚期炎症因子ＨＭＧＢ１表达逡逑的影响，进而为肠上皮屏障的损伤、修复机制及阻止肠上皮屏障受损导致脓毒症逡逑和ＭＯＤＳ提供新的治疗策略和理论依据。逡逑

细胞生长曲线,浓度,共培养,细胞

为Ｃａｃｏ－２细胞生长曲线，２－Ｂ为ＬＰＳ最佳刺激浓度，２－Ｃ为ＲＰＴＳ与１００（ａｇ／ｍｌ邋ＬＰＳ逡逑共培养的最佳刺激浓度，２－Ｄ为ＥＰ与ｌＯＯ＾ｉｇ／ｍｌ邋ＬＰＳ共培养的最佳刺激浓度）逡逑２ＬＰＳ、ＲＰＴＳ、ＥＰ最佳刺激浓度逡逑不同浓度ＬＰＳ刺激Ｃａｃｏ－２细胞ＭＴＴ检测显示，随着浓度梯度递增ＯＤ值逡逑递减，，１００ｐｇ／ｍｌ邋ＬＰＳ下降至空白对照组ＯＤ值一半左右，此浓度下Ｃａｃｏ－２细胞逡逑生长活性明显受限，倒置显微镜观察可见细胞数目显著减少，部分区域有缺失空逡逑洞形成，漂浮细胞多，细胞形态不规则，折光性减弱。即ＬＰＳ最佳刺激浓度为逡逑１０0Ｈｇ／ｍｌ。见图邋２－Ｂ。逡逑不同浓度ＲＰＴＳ与］ＯＯｐｇ／ｍｌ邋ＬＰＳ共培养ＭＴＴ检测显示，Ｏ．ｌ＾ｇ／ｍｌ和ｌｐｇ／ｍｌ逡逑浓度下，ＯＤ值升高。当ＲＰＴＳ＾１０（ｉｇ／ｍｌ时，ＯＤ值随浓度升高逐渐下降，且低逡逑于１００ｐｇ／ｍｌ邋ＬＰＳ干预组ＯＤ值。即ＲＰＴＳ与ｌＯＯ＾ｇ／ｍ丨ＬＰＳ共培养的最佳刺激浓逡逑度为ｌｐｇ／ｍｌ。见图２－Ｃ。逡逑
【学位授予单位】：昆明医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R459.7

【参考文献】