VEGI对颅脑创伤急性期血脑屏障通透性的影响及机制研究

发布时间：2020-05-30 22:24

【摘要】：研究目的:创伤性颅脑损伤(Traumatic brain injury,TBI)以其高致死致残率成为世界范围内重要公共卫生问题。创伤后原发性血脑屏障破坏导致脑血流灌注不足、血脑屏障通透性升高,代谢失衡、出凝血障碍等病理过程,引起继发性脑损伤,加重血脑屏障开放,形成恶性循环。及时修复血脑屏障成为TBI治疗的关注重点之一。血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)又被称作血管通透性因子,在血脑屏障开放、血管新生中起到重要作用。血管内皮生长抑制因子(Vascular endothelial growth inhibitor,VEGI)是机体内天然抑制VEGF的因子,且在抑制VEGF的同时并不影响血管内皮细胞的正常功能。因此,本实验在建立TBI动物模型的基础上,检测TBI后不同时间点VEGF和VEGI的表达变化,探讨二者与血脑屏障通透性的相关联系。通过侧脑室注射VEGI纯化蛋白对TBI急性期小鼠进行干预治疗,观察TBI后VEGF表达变化,血脑屏障通透性的改变,创伤侧细胞凋亡水平和小鼠神经运动功能。同时,探究VEGI对VEGF的下游作用机制,及其在TBI急性期抑制血管新生的作用机制。研究方法:1)在C57BL/6雄性小鼠上建立TBI模型,应用Western Blot技术检测TBI后不同时间点创伤侧纤维蛋白原的含量。2)应用Western Blot技术分别检测TBI后不同时间点VEGF和VEGI的各自表达量。3)应用立体定位侧脑室微量注射技术,对TBI后小鼠进行VEGI干预。4)通过改良的神经功能缺损评分(modified Neurological Severity Score,mNSS)和错步实验对实验各组进行神经功能评分。筛选出差异最大时间点,进行后续探究。5)应用Western Blot和免疫荧光技术检测比较TBI第3天对照组和干预组血脑屏障通透性的变化。6)应用Western Blot技术检测VEGFR2和下游eNOS的磷酸化表达。7)应用流式细胞技术和AnnexinV/PI试剂盒检测比较创伤对照组和VEGI干预组小鼠创伤侧细胞凋亡情况。8)应用Western Blot、免疫荧光技术观察血管新生相关细胞的变化。9)体外实验中比较VEGI对内皮细胞和周细胞成管能力的影响。10)应用Western Blot技术检测血管新生相关因子的相对表达变化。结果:1.TBI后小鼠血脑屏障开放在第3天最为显著。VEGF在TBI后逐渐升高,第3天达峰值。VEGI在TBI后第3天下降明显。综合比较VEGF与VEGI比值发现,VEGF/VEGI值在TBI后逐渐升高,在第3天最为明显。2.VEGI干预后对TBI小鼠神经运动功能改善从第3天开始出现明显差异。VEGI干预明显减少创伤侧的细胞凋亡数量,减轻了血脑屏障开放程度。VEGI干预可以显著抑制TBI急性期创伤侧VEGFR2和其下游eNOS的磷酸化。3.VEGI干预显著抑制了TBI后的血管新生,体现在对血管新生相关细胞的抑制和对血管新生相关因子之间平衡的调节。结论:1.TBI急性期后VEGF的单一变化不能完全解释血脑屏障通透性升高的时间峰值,综合VEGF与VEGI相对变化可能会更有效的研究TBI后血脑屏障损伤的原因。TBI急性期第3天VEGF相对于VEGI的高表达可能为血脑屏障通透性峰值的原因之一,为后续TBI急性期的治疗奠定基础。2.VEGI局部干预在TBI急性期对神经功能的改善作用集中于TBI后第3天,我们选用创伤后第3天为后续实验的重要观察点。3.VEGI通过减少紧密连接蛋白的损伤,降低基质金属蛋白酶的表达,抑制VEGF-VEGFR-2下游的磷酸化,有效地降低了血脑屏障通透性。VEGI局部干预在TBI后第3天有效抑制创伤侧的细胞凋亡。4.VEGI干预一定程度上恢复了TBI后促血管新生相关因子和抑制血管新生因子表达的失衡,减少了未成熟的新生血管的形成,以阻止血脑屏障通透性进一步的升高,从而缓解TBI后的继发性损伤。
【图文】：

纤维蛋白原,继发性,创伤,血脑屏障通透性

正常脑组织的纤维蛋白原含量很低（如图1.1 中的 sham 假手术组），仅为血管中的少许残留，而由于创伤导致血管的直接损伤或组织缺氧造成的继发性血脑屏障通透性升高，使原本在血管中的纤维蛋白原会渗出至脑组织中[6]。在损伤程度一定的情况下，局部组织中的纤维蛋白原表达量越高，提示血管通透性越高，可能引起的继发性血管源性水肿越严重。本实验应用 Western Blot 技术分别观察 TBI 后第 1、3、7 天创伤半球纤维蛋白原表达，结果显示（图 1.1）创伤后纤维蛋白原表达逐渐升高，于第 3 天达峰值(p***<0.001)，后下降，第 7 天时接近假手术组水平，并于第 3 天的含量由显著性差异（p#<0.05）。提示，TBI 急性期以第 3 天为血脑屏障开放峰值

创伤,比值,急性期,蛋白含量

1.2.2 TBI 急性期中不同时间点 VEGF 与 VEGI 的相对表达检测。本实验分别观察 TBI 后第 1、3、7 天 TBI 半球 VEGF 和 VEGI 的蛋白表达含量。图 1.2 结果显示，相较假手术组中 VEGF 的蛋白含量，TBI 后 VEGF 表达逐渐升高，于第 3 天时达峰值（p***<0.01）并持续至第 7 天（p**<0.01）；而 VEGI的蛋白在假手术组中（相较 VEGF）具有较高的表达，TBI 后第一天有下降趋势，但并未达到统计学差异。于 TBI 后第 3 天达谷值（p*<0.05），后呈现逐渐恢复趋势，即在 TBI 后第 7 天时蛋白含量与假手术组相比无统计学差异。我们由此将二者综合计算不同时间点的 VEGF 与 VEGI 相对比值（VEGF/VEGI 比），并对此进行统计，结果显示 VEGF/VEGI 比在 TBI 后第 3 天显著升高（p***<0.001），在TBI 后第 7 天有所下降，仍然高于假手术组(p*<0.05), 但是与第 3 天比较有显著降低（p##<0.01）。提示：TBI 后急性期 VEGF 与 VEGI 的相对变化可能比单一因素的变化更为显著，并可能与 TBI 急性期并发症相关。同时，由于 TBI 后第3 天的多种因素变化最为明显，所以该时间点被选作为后续进一步研究观察时间点。
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R651.15

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