Nrf2在小鼠脑挫伤后动态表达及其神经保护作用机制研究

发布时间：2020-06-20 18:36

【摘要】：目的:创伤性脑损伤(Traumatic Brain Injury,TBI)是由直接外力引起的脑组织结构破坏和功能障碍,具有高发病率、高致残率和高死亡率的特点。TBI是青壮年死亡和残疾的最主要的原因,全世界每年约近五千万人会遭受脑挫伤。TBI所致脑损伤包括外力直接作用引起的原发性损伤以及随后发生的继发性损伤。原发性损伤包括脑挫伤、脑血管损伤、轴索损伤等。继发性损伤是直接损伤造成的一系列细胞及生化级联反应,是导致脑损伤死亡或功能障碍的重要原因,包括氧化应激、谷氨酸兴奋性毒性、炎症反应、细胞凋亡等。氧化应激和炎症是继发性损伤的重要机制,理论上提高抗氧化反应和降低炎症反应可以减轻TBI引起的继发性脑损伤。核因子E2相关因子2(Nuclear factor-erythroid derived 2-related factors,Nrf2),属于CNC-bZIP(cap‘n’collar subfamily of basic leucine zipper),即CNC亮氨酸拉链转录激活因子家族,是细胞抗氧化应激反应的中枢调节因子。生理状态下,Nrf2与其胞浆蛋白伴侣分子Keap1(Kelch-like ECH associated protein1)结合形成稳定的二聚体,并锚定于细胞质的肌动蛋白上,导致Nrf2迅速泛素化和蛋白酶体依赖性的降解。当细胞处于氧化应激状态下,受到亲电子化合物或氧化物作用时,Nrf2和Keap1解偶联,由细胞质转移至细胞核内,与小Maf蛋白或其他bZIP蛋白结合成异二聚体,识别并结合抗氧化反应元件(Antioxidant response element,ARE)或亲电子元件(Electrophile Response Elements,EpRE)上的相应序列,从而启动下游基因的转录。研究表明,Nrf2在脑损伤和神经退行性疾病中发挥重要的神经保护作用。小鼠TBI后,Nrf2被激活,诱导细胞抗氧化反应。当小鼠缺乏Nrf2时,TBI引起更严重的氧化应激性损伤和功能障碍,Nrf2激动剂(包括萝卜硫素、叔丁基苯二酚等)则可以明显改善TBI引起的继发性损伤。我们推测,Nrf2可能是临床上治疗脑挫伤的重要靶点。姜黄素(curcumin)是从姜黄Curcuma longa L中分离出来一种化合物。姜黄素具有抗炎和抗氧化等生物学活性。迄今为止,研究者已经完成了100多项针对姜黄素的临床试验,这充分展现了姜黄素的安全性、耐受性及用于疾病治疗的有效性。研究表明,在TBI和缺血再灌注损伤中,姜黄素可以通过血脑屏障进而发挥神经保护作用,包括:改善脑水肿、炎症、细胞稳态、突触可塑性等,但其分子机制目前尚不清楚。细胞和动物实验研究表明,姜黄素可以激活Nrf2通路,但姜黄素是否通过激活Nrf2通路实现TBI后的神经保护作用,目前尚不清楚。在本实验中,内源性Nrf2通路在小鼠TBI后被激活,我们首先研究了Nrf2在TBI后损伤周边区神经元和胶质细胞内的表达变化,为法医学实践中推断脑损伤时间寻找生物学标志物。接下来,我们应用WT和Nrf2-KO小鼠给予姜黄素或溶剂,研究姜黄素是否通过激活Nrf2通路实现TBI后的神经保护作用,为临床上以Nrf2为靶点开展神经保护性治疗提供依据。研究方法:取8 12周成年雄性野生(WT)小鼠和Nrf2敲除(Nrf2-KO)小鼠(20 26g),应用改良的Fenney的自由落体法制作中度脑挫伤模型。第一部分:将WT小鼠随机分为假手术组(Sham)和脑挫伤组(TBI),并于TBI后1d、3d、7d和14d腹腔注射过量戊巴比妥钠处死实验小鼠并取脑组织。应用Western blot检测TBI后不同时间段Nrf2的蛋白表达,同时应用免疫荧光染色检测Nrf2在神经元(NeuN)、星形胶质细胞(GFAP)、小胶质细胞(IBA1)和NG2胶质细胞内的表达变化。第二部分:将WT和Nrf2-KO小鼠分别随机分为假手术组(Sham)和脑挫伤组(TBI),TBI组又随机分为溶剂处理组(TBI+Veh)和姜黄素处理组(TBI+Cur)。TBI后24h腹腔注射过量戊巴比妥钠处死实验小鼠并取脑组织。应用Western blot和qRT-PCR检测Nrf2及其下游基因(Hmox-1,Nqo1,Gclm,and Gclc)的蛋白和mRNA表达;检测氧化应激性损伤(测定MDA水平)、脑水肿(测定brain water content)、神经细胞变性(FJC、Tuj1免疫荧光染色)、细胞凋亡(Western blot检测cleaved caspase-3、Bcl-2;TUNEL染色)及炎症反应(qRT-PCR检测TNF-α,IL-6和IL-1β;MPO、IBA1免疫荧光染色)等相关指标。结果:第一部分:Nrf2的蛋白表达水平在TBI后1d达到高峰,以后逐渐下降。TBI后Nrf2在神经元内呈一过性高表达,在伤后1d达到高峰,之后急剧减少。Nrf2在星形胶质细胞内呈持续性低表达,Nrf2阳性星形胶质细胞数量在伤后7d达到高峰。TBI后Nrf2在小胶质细胞内表达明显增高,Nrf2阳性小胶质细胞数量在伤后7d达到高峰。我们也检测了Nrf2在NG2胶质细胞内的表达,Nrf2在NG2胶质细胞中的表达比率在伤后3d达到高峰。第二部分:在野生小鼠中,与溶剂处理组相比,姜黄素处理后,Nrf2及其下游基因表达水平明显升高,而且Nrf2入核增加;氧化应激性损伤减轻,脑水肿改善,变性神经细胞数量减少,存活神经元数量增加,细胞凋亡明显改善,炎症反应降低。在Nrf2-KO小鼠中,Nrf2及其下游基因表达水平明显降低;氧化应激性损伤、脑水肿加重,变性神经细胞数量增加,存活神经元数量明显降低,细胞凋亡明显加重,炎症反应增强。Nrf2-KO小鼠给予姜黄素处理后,未出现在WT小鼠实验中的明显的神经保护作用。结论:1、小鼠脑挫伤后,Nrf2在神经元和胶质细胞内表达增高。2、小鼠脑挫伤后,Nrf2在神经元和胶质细胞内表达存在时间规律性。3、小鼠脑挫伤后,内源性Nrf2通路被激活,姜黄素处理后,Nrf2通路被进一步激活。4、姜黄素通过激活Nrf2通路实现TBI后的神经保护作用。5、姜黄素通过激活Nrf2通路实现TBI后的抗炎、抗凋亡和抗氧化作用。
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R651.15
【图文】：

模式图,皮质,小鼠,脑挫伤

8图 1 小鼠 TBI 后伤侧皮质损伤周边区的形态学变化（A）小鼠中度脑挫伤模式图，红色区域为挫伤区，蓝色与红色之间区域为损伤周边区；（B）小鼠中度脑挫伤后 24h，脑组织 HE 染色代表性图片；（C）不同时间损伤周边区 HE 染色代表性图片。Scale bar, 50 μm。3.2 小鼠 TBI 后伤侧皮质损伤周边区 Nrf2 蛋白表达应用WB检测了小鼠不同损伤时间后伤侧皮质损伤周边区Nrf2的蛋白表达水平。伤后 1d，Nrf2 蛋白表达水平明显增高，随后其表达水平逐渐下降（图 2）。

脑挫伤,检测结果,神经元

图 2 小鼠脑挫伤后不同时间 Nrf2 的 Western blot 检测结果小鼠脑挫伤后不同时间损伤周边区 Nrf2 的蛋白表达水平。* p < 0.05 vs. 正常对照组 vs. 相邻上一组 (n = 6).3 小鼠 TBI 后伤侧皮质损伤周边区神经元内 Nrf2 的表达免疫荧光染色结果显示，在正常脑皮质神经元（NeuN+）内，免疫荧光显的 Nrf2 阳性荧光信号（表达）。脑挫伤后，NeuN 阳性细胞数量在伤明显减少，之后趋于稳定（图3B）。伤后1d可见大量Nrf2阳性神经元（NeuN+ 3C），其中，Nrf2 阳性神经元占到神经元数量的 80.2%（图 3D，表 1）。引起的神经元内 Nrf2 高表达属于一过性表达，在伤后 3d，表达 Nrf2 的明显减少（图 3C），Nrf2 阳性神经元比率也显著下降（图 3D）。虽然在可见神经元细胞核内 Nrf2 表达，但脑挫伤后神经元内 Nrf2 表达主要集中

【参考文献】