胆碱能抗炎通路调节肺泡巨噬细胞极化减轻急性肺损伤的机制研究

发布时间：2020-07-24 07:50

【摘要】：背景与目的:急性肺损伤(ALI)为脓毒症的常见并发症,发病率和死亡率居高不下。肺泡巨噬细胞(AM)在ALI的防御和修复中起着重要的作用。在不同微环境刺激下,巨噬细胞可发生M1和M2极化,但AM的极化及对ALI的影响尚不明确。GTS-21为胆碱能抗炎通路(CAP)选择性α 7烟碱型乙酰胆碱受体激动剂(α7nAChR),在ALI的治疗中具有广阔的应用前景。然而,GTS-21介导的抑制炎症反应的分子机制仍有部分不清楚。高迁移率族蛋白-1(HMGB1)可激活黑素瘤缺乏因子2(AIM2)炎症小体复合物引起促炎反应,且两者在ALI中均具有重要的作用。然而HMGB1与AIM2之间的相互作用机制尚不清楚。巨噬细胞可表达AIM2炎症小体复合物和HMGB1的主要受体:晚期糖基化终产物受体(RAGE)、Toll样受体2、4(TLR 2、TLR4)来传递细胞内信号。研究目的:1.探索GTS-21通过调节AM的极化功能来参与脂多糖(LPS)所致ALI的抗炎机制;2.探索HMGB1通过调节AM的极化功能来参与LPS所致ALI的炎症反应机制。方法:第一部分:从C57BL/6小鼠肺泡灌洗液(BALF)中提取AM,刺激后极化为M1型AM和M2型AM。再将M1和M2型AM分别注入去除AM的小鼠气道,然后建立LPS所致ALI模型,观察M1和M2型AM对LPS所致ALI小鼠肺损伤评分、肺水肿程度和肺部炎症因子的影响。第二部分:建立LPS所致ALI小鼠模型,分为空白对照组、LPS组、GTS-21组和GTS-21+LPS组。体外培养AM,在有无LPS和有无GTS-21的刺激下,分为同样四组。通过体内和体外实验观察GTS-21对LPS所致ALI中AM的数量、AM的极化以及对HMGB1分泌的影响。第三部分:应用anti-HMGB1或rHMGB1干预LPS所致ALI小鼠,测定干预措施对肺组织炎症损伤、AIM2炎症小体复合物的蛋白以及mRNA表达。通过流式细胞学检测M1型AM表面相关因子(MHCⅡ、CD80、CD86、CD40)和M2型AM表面相关因子(CD206、IL-10)的表达水平。体外培养骨髓来源的巨噬细胞,观察Anti-HMGB1或rHMGB1刺激后AIM2炎症小体复合物的蛋白以及mRNA表达以及M1和M2型AM表面相关因子的表达。第四部分:为了验证HMGB1对巨噬细胞的作用通路,应用anti-HMGB1或rHMGB1作用于LPS所致ALI小鼠,观察TLR2/4、RAGE受体和NF-κB表达水平的变化;应用TLR2/4和RAGE受体拮抗剂作用于LPS所致ALI小鼠,观察肺部炎症和AIM2炎症小体复合物的变化。在体外培养的巨噬细胞中加入以上干预措施,观察AIM2炎症小体复合物的变化。结果:(1)M1型AM可加重LPS所致ALI的促炎反应。主要表现为:肺MPO活性增强,肺W/D上升,BALF中(TNF-α、IL-6、IL-1β、MCP-1)的水平明显增高。M2型AM可减轻LPS所致ALI小鼠的炎症反应,主要表现为肺损伤评分降低,肺MPO活性和肺W/D减低,BALF中MCP-1的水平降低。(2)在LPS所致ALI小鼠中,GTS-21可减轻肺组织炎症,减少AM的数量及炎症因子的表达,降低肺组织、血浆以及BALF中HMGB1的分泌和表达。GTS-21可降低LPS所致ALI小鼠和体外培养的AM中M1型AM生物活性分子iNOS和促炎因子(TNF-α、IL-6、IL-12)的水平,增加M2型AM生物活性分子 Arg1、Ym1 和抗炎因子(CCL17、CCL22、CCL24)的水平。(3)抗HMGB 1抗体可减轻LPS所致ALI小鼠肺组织炎症,抑制AIM2炎症小体复合物的活性,抑制AM向M1极化;rHMGB1可增加LPS所致ALI小鼠肺组织炎症,增强AIM2炎症小体复合物的活性,促进AM向M1极化。(4)抗HMGB 1抗体可下调LPS所致ALI中TLR 2、TLR 4和RAGE/NF-κB的表达;rHMGB 1可上调上述受体的表达;(TLR2、TLR4受体拮抗剂)LPS-RS和(RAGE受体拮抗剂)FPS-ZM1能抑制LPS所致ALI肺部炎症,降低AIM 2炎症小体复合物的表达。结论:(1)M1型AM可加重LPS所致ALI肺组织炎症;M2型AM可减轻LPS所致ALI肺组织炎症。(2)胆碱能抗炎通路可通过减少AM的数量,抑制M1型AM的极化,抑制AM内HMGB 1的分泌来减轻LPS所致ALI。(3)HMGB1可通过激活AIM2炎症小体复合物和促进AM的M1极化来参与LPS所致ALI的炎症反应过程。(4)在LPS所致ALI中,HMGB1激活AIM2炎症小体复合物和促进巨噬细胞的M1极化的作用可能是通过TLR2、TLR4、RAGE和NF-κB通路来实现的。
【学位授予单位】：武汉大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R563.8
【图文】：

小鼠,过继转移,肺组织

－１邋Ｍｌ型ＡＭ加重ＡＬＩ小鼠肺组织炎症浸润。（ａ）肺组织切片的ＨＥ染色（＞＜４００）和（ｂ）分结果。Ａ为对照组，Ｂ为ＬＰＳ诱导的急性肺损伤组（ＬＰＳ），邋Ｃ为ＡＭ去除的肺损Ｓ＋ＣＬ）、Ｄ为ＡＭ去除的肺损伤＋Ｍ１－ＡＭ过继转移组（ＬＰＳ＋ＣＬ＋Ｍｌ），邋Ｅ为ＡＭ去除＋Ｍ２－ＡＭ过继转移组（ＬＰＳ＋ＣＬ＋Ｍ２）。图中箭头所指为肺泡腔内肺泡巨噬细胞（ＡＭ）。据应用均ex土标准误表示（每组４－６只小鼠）。＊Ｐ＜０．０５．＊＊Ｐ＜０．０１，＊＊叩＜０．００１。逡逑邋Ｍｌ、Ｍ２型ＡＭ对ＬＰＳ所致ＡＬＩ小鼠肺Ｗ／Ｄ和ＭＰ性的影响逡逑Ｗ／Ｄ结果反应肺水肿程度，Ｍ．ＰＯ活性为中性粒细胞功能和聚集程度指标，间接反映了肺组织的炎症浸润程度。通过测定各组中这两个指标变步反映Ｍｌ型ＡＭ或Ｍ２型ＡＭ对ＡＬＩ小鼠肺部炎症反应的影响。结ｌ－２ａ、ｂ所示，当ＬＰＳ组与对照组相比时Ｗ／Ｄ和ＭＰＯ值均明显增高；ＡＭＡＬＩ小鼠肺组织匀浆内所测得ＭＰＯ值明显升高，但Ｗ／Ｄ未发现明显差Ｓ＋ＣＬ＋Ｍ１组与ＬＰＳ＋ＣＬ组和ＬＰＳ＋ＣＬ＋Ｍ２组相比较时Ｗ／Ｄ和ＭＰＯ值均

小鼠,过继转移,肺损伤,肺水肿

Ａｔ？＝逦＿逦－逦－逡逑图１－１邋Ｍｌ型ＡＭ加重ＡＬＩ小鼠肺组织炎症浸润。（ａ）肺组织切片的ＨＥ染色（＞＜４００）和（ｂ）肺损逡逑伤评分结果。Ａ为对照组，Ｂ为ＬＰＳ诱导的急性肺损伤组（ＬＰＳ），邋Ｃ为ＡＭ去除的肺损伤组逡逑（ＬＰＳ＋ＣＬ）、Ｄ为ＡＭ去除的肺损伤＋Ｍ１－ＡＭ过继转移组（ＬＰＳ＋ＣＬ＋Ｍｌ），邋Ｅ为ＡＭ去除的肺逡逑损伤＋Ｍ２－ＡＭ过继转移组（ＬＰＳ＋ＣＬ＋Ｍ２）。图中箭头所指为肺泡腔内肺泡巨噬细胞（ＡＭ）。所逡逑有数据应用均ex土标准误表示（每组４－６只小鼠）。＊Ｐ＜０．０５．＊＊Ｐ＜０．０１，＊＊叩＜０．００１。逡逑３．２邋Ｍｌ、Ｍ２型ＡＭ对ＬＰＳ所致ＡＬＩ小鼠肺Ｗ／Ｄ和ＭＰＯ逡逑活性的影响逡逑Ｗ／Ｄ结果反应肺水肿程度，Ｍ．ＰＯ活性为中性粒细胞功能和聚集程度的重逡逑要指标，间接反映了肺组织的炎症浸润程度。通过测定各组中这两个指标变化可逡逑进一步反映Ｍｌ型ＡＭ或Ｍ２型ＡＭ对ＡＬＩ小鼠肺部炎症反应的影响。结果如逡逑图ｌ－２ａ、ｂ所示，当ＬＰＳ组与对照组相比时Ｗ／Ｄ和ＭＰＯ值均明显增高；ＡＭ去逡逑除后ＡＬＩ小鼠肺组织匀浆内所测得ＭＰＯ值明显升高，但Ｗ／Ｄ未发现明显差异；逡逑ＬＰＳ＋ＣＬ＋Ｍ１组与ＬＰＳ＋ＣＬ组和ＬＰＳ＋ＣＬ＋Ｍ２组相比较时Ｗ／Ｄ和ＭＰＯ值均明显逡逑增高；而ＬＰＳ＋ＣＬ＋Ｍ２组与ＬＰＳ＋ＣＬ组相比较时Ｗ／Ｄ和ＭＰＯ值均明显降低。逡逑以上结果说明：ＡＭ参与调节ＡＬＩ小鼠肺水肿和中性粒细胞浸润的调节

肺部炎症,调节作用,炎症因子,变化观

通过对分离出的ＡＭ进行流式细胞学检测，筛选出ＣＤＩ１Ｔ４／８０－的细胞，即为逡逑ＡＭ。然后通过分析ＧＴＳ－２１干预后，ＡＭ数目的变化观察ＧＴＳ－２１是否对ＡＭ的逡逑数量有影响。如图２－２邋（ａ、ｂ）所示，ＬＰＳ组中ＡＭ的数量较对照组明显增高，而逡逑经过ＧＴＳ－２１后，ＡＭ数量较未干预组明显下降。也就是说，ＧＴＳ－２１可减少ＬＰＳ逡逑小鼠ＡＭ的数量。通过染色，测定ＡＭ表面主要表达的炎症因子：其中ＩＬ－６和逡逑ＩＬ－１２ｐ４０为促炎因子，ＩＬ－１０为抗炎因子的比例。图２－２邋（ｃ、ｄ）所示，ＬＰＳ＋ＧＴＳ－２１逡逑３９逡逑

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