重组血栓调节蛋白N端结构域抑制肝组织损伤的研究

发布时间：2020-07-25 09:48

【摘要】：第一部分原核表达并纯化血栓调节蛋白N端结构域和HMGB1 目的：原核表达并纯化纯度较高的血栓调节蛋白N端结构域和HMGB1,获得相应蛋白。方法：取正常小鼠肝组织提取总RNA作为模板,根据目的基因的要求,设计两对引物,经RT-PCR转录出血栓调节蛋白N端结构域和HMGB1基因片段并扩增；两种基因片段与PMD-18T克隆载体的连接,构建克隆载体PMD-18T-TM-N和PMD-18T-HMGB1,经专业生物公司测序确定后；分别转化至大肠杆菌E.coli DH5a,大量克隆并提取,双酶切后,分别与同样双酶切之后的表达载体PET-28a连接,得到带6-His标签的表达载体PET-28a-TM-N和PET-28a-HMGB1,测序正确；分别转化至大肠杆菌BL21,分别用不同浓度异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(ITPG)诱导,Ni2+-NTA树脂层析柱纯化得到目的蛋白(TM-N为包涵体,逐步透析降低尿素浓度,使之自动折叠复性)。结果：得到TM-N与HMGB1基因的原核表达质粒PET-28a-TM-N和PET-28a-HMGB1,双酶切、PCR、测序得知各基因均正确的插入到原核质粒中；诱导纯化分离得到的蛋白经SDS-PAGE检测证明为TM-N与HMGB1蛋白。结论：成功得到PET-28a-TM-N与PET-28a-HMGB1,并得到重组TM-N与HMGB1蛋白。第二部分重组蛋白在小鼠肝衰竭模型中的作用目的：研究HMGB1对小鼠肝脏的损伤作用及作用通路；研究血栓调节蛋白N端结构域在小鼠肝衰竭模型中的作用。方法： 1. C57BL普通小鼠随机分为3组,以下药物均腹腔注射：对照组：D-Galn600mg/kg、LPS5μg/kg;实验组：HMGB1150μg/kg;空白组：等量生理盐水。分别于2、6、12、24h经眼眶取血,取血后颈椎脱臼处死,取肝组织固定12h,制成石蜡切片HE染色。免疫组织化测肝组织中HMGB1的表达、免疫荧光法检测肝组织NF-κB、 RT-PCR测HMGB1-mRNA变化趋势、ELISA测血清ALT、TNF-α,HMGB1配对t检验进行统计学处理。 2.TLR4基因敲除小鼠按1.方法分组、注射药物、取肝组织和血清及检测。 3.构建普通小鼠肝衰竭模型,腹腔注射重组TM-N,余按照1.方法进行。结果： 1.在普通小鼠中：腹腔注射D-Galn和LPS的对照组和腹腔注射HMGB1的实验组均出现严重的肝组织坏死,免疫组化和RT-PCR可知肝组织内均有HMGB1的大量表达,血清内HMGB1也均明显升高(24小时对照组为189.91±21.31ng/ml,实验组为234.25±17.03ng/ml),远高于空白组(1.99±0.85ng/ml)；血清内ALT均明显升高(12小时峰值对照组为144.27±20.37U/L,实验组为127.42±11.05U/L),远高于空白组(9.19±3.57U/L)。免疫荧光检测NF-κB也显示,对照组与实验组均出现明显表达。 2.在TLR4基因敲除小鼠中：腹腔注射D-Galn和LPS的对照组与注射盐水的空白组一样,肝组织完全正常,组化切片和RT-PCR可知肝组织内仅细胞核内少量表达HMGB1,细胞浆无HMGB1表达,血清内ALT和HMGB1也无升高；注射HMGB1的实验组出现严重的肝组织坏死,肝损伤作用但较普通小鼠实验组肝损稍轻；组化切片和RT-PCR可知肝组织内均有HMGB1的大量表达,血清内HMGB1(对照组峰值为24小时194.63±12.74ng/ml)和ALT(对照组峰值为12小时157.36±23.79U/L)较空白组均明显升高。 3.腹腔注射rTM-N,肝组织HE染色显示实验组肝损伤明显减轻,免疫组化检测HMGB1和TM均显著少于对照组；免疫荧光检测NF-κB显著少于对照组。PCR检测肝组织HMGB1-mRNA,实验组各个时间点表达水平明显低于对照组,12h峰值为98.44±13.69倍远低于对照组的200.54±24.57倍(P0.05)见图14；实验组各个时间点TM-mRNA水平也明显低于对照组,12h峰值为21.46±2.79倍远低于对照组的58.63±5.78倍(P0.05)。实验组血清中各时间点ALT、TNF-α和HMGB1的水平明显低于对照组,实验组ALT、TNF-α和HMGB1峰值分别为68.33±10.29(24小时)、355.42±53.55(12小时)和64.38±4.92(24小时),显著低于对照组,分别为127.42±11.05(12小时)、634.23±35.18(6小时)和234.25±17.03(24小时),P0.05。结论：1.HMGB1和LPS一样,也可以激活NF-κB及其下游通路,导致普通小鼠肝脏严重的损伤； 2.LPS不能导致TLR4基因敲除小鼠的肝损伤,提示LPS主要通过TLR4受体发挥; 3.TLR4受体的敲除,对于HMGB1的致炎作用影响并不大,因此HMGB1同样能导致TLR4基因敲除小鼠严重的肝损,推测HMGB1的致炎作用通路可能主要为RAGE受体。 4. rTM-N能够减少HMGB1?TM和NF-kB的分泌,减少肝衰竭中血清谷丙转氨酶含量,改善肝功能,减小肝组织损伤,降低血管内皮损伤程度。第三部分重组TM-N蛋白在体外的抗炎作用目的：观察重组TM-N蛋白在体外的抗炎作用。方法：用LPS或rHMGB1刺激小鼠肝窦内皮细胞,加入不同浓度血栓调节蛋白N, CCK8法检测不同时间点细胞活力；免疫荧光检测细胞内HMGB1、TM和NF-κB; ELISA法细胞上清中TNF-α的含量；RT-PCR检测HMGB1-mRNA或TM-mRNA相对空白组变化趋势。结果：CCK8实验表明：LPS的刺激下,2小时各组细胞活力几乎是一致,各组无统计学差异(P0.05),随着时间的推移,实验组各时间点细胞活力始终均大于对照组,rTM-N浓度为100ng/ml时能够使细胞活力持续维持在90%以上,48h时实验组细胞活力为92.825%±2.42%,对照组为65.24%±3.79%(P0.05),rTM-N浓度越大细胞活力有所减少,但均大于80%；在rHMGB1的刺激下,实验组细胞活力始终大于对照组,rTM-N浓度越大活力越大,rTM-N浓度为1ug/ml时能够使细胞活力维持在85%以上,48h细胞活力实验组为84.33%±3.69%,对照组为51.635%±2.55%,细胞活力明显提高,有统计学差异(P0.05) 免疫荧光实验中,在LPS刺激下,镜下观和IOD值都提示,实验组细胞中NF-kB, HMGB1或TM较对照组分布减少,颗粒荧光减弱。RT-PCR显示实验组细胞HMGB1-mRNA或TM-mRNA表达减少。结论：因此rTM-N可以减轻LPS或HMGB1对细胞的毒性作用、增强细胞活性。LPS能够刺激小鼠肝窦内皮细胞产生大量的HMGB1,加入rTM-N蛋白能够减少LSEC分泌HMGB1、TM及NF-KB,减轻内皮细胞的损伤程度。
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R575.3

【共引文献】