光谱诊断烧伤创面深度和渗出液含量及纳米膜促进创面愈合的研究

发布时间：2020-08-06 18:32

【摘要】：我国每年因各种原因而引起皮肤烧伤的人数大约在500万至1000万人,烧伤后死亡率、容貌毁损率及致残率高,患者的救治周期和康复周期较长,甚至直接威胁患者的生命安全和机体健康,因此对烧伤创面早期精确的诊断和及时准确的治疗,显得尤为重要。对于烧伤的诊断而言,在没有外在客观辅助诊断的帮助下,仅凭烧伤临床表现和经验,烧伤医生对烧伤深度的准确率仅在60%-75%之间,因此近年来对各种辅助诊断技术的研究层出不穷,包括如B超、MRI、血管显微镜、荧光染色、THZ、多光谱等多种技术手段,但其研究基本都局限于传统的三度四分法上,并不能精确探测出烧伤皮肤坏死组织的具体深度,传统的病理检测可以做到,但因其侵入性操作、会造成永久性创面等原因而不能广泛用于临床。迄今为止,尚无公开报道有相关技术用于精确探测烧伤皮肤坏死组织的具体深度。若有一种技术方法可以对烧伤皮肤坏死组织深度进行精确测量,不但能够为烧伤深度的诊断提供一种新的精确的分类方法,而且还能为精确化清创提供客观参考依据,大大减小烧伤临床实践的不确定性,在保证清创彻底的同时尽可能将损伤控制到最低,最大程度的保留皮肤附件及其相关干细胞,对提高创面愈合质量,减少疤痕形成具有重要意义。对于烧伤的治疗来说,皮肤创面暴露于空气中后,必须使用敷料覆盖,作为屏障,起到临时的保护作用。这里面临两个问题,一个是对于应用于临床的创面敷料,何时进行更换的问题。烧伤创面换药一直以来都依赖于临床医生的经验,大多采用两天换一次药的方式进行,迄今为止尚没有一个客观的评价标准精确的告诉烧伤医生应当何时换药。创面渗出液完全浸透医用敷料,是提醒医生必须立即换药的一个明显标志,但若等肉眼都能够判断出创面渗出液完全浸透医用敷料时再换药,那么在换药之前创面已受感染的风险太高;但若更换敷料太早,则会造成部分医疗资源和人力资源的浪费。因此,如果有种方法能够在创面渗液足量但是还未能完全浸透敷料的时刻提醒医生换药,那么就能在控制一定感染风险的前提下尽可能的减少换药,不但能减少病人的痛苦和负担,还能减少部分人力和医疗资源的浪费。另一个问题是,临床敷料多种多样,如何选择和制作新型创面敷料问题。近40年来国内外研制开发了多种创面覆盖敷料,并广泛应用于临床。合成类敷料里的组织工程敷料是近年来发展起来的新一代人工合成类敷料,特别是随着静电纺丝技术地逐步深入研究,静电纺丝纤维膜敷料发展成为了新一代的热点研究的皮肤创面敷料。由于静电纺丝纤维膜自身特性制约,静电纺丝纤维膜敷料不含促愈因子,现有公开报道的研究中在静电纺丝纤维膜加载促愈因子的敷料不但工艺复杂且不能缓慢释放促愈因子,造成材料促愈效果欠佳,临床转化也有困难。因此若我们能够通过简单的方法制作出在静电纺丝纤维膜上加载缓慢释放促愈因子的创面敷料,并证明该种材料对创面愈合的影响和机制,那么我们就可以为临床选择和制作此类新型创面敷料提供一种新思路,丰富相关创面敷料促进创面愈合的理论基础,为下一步临床转化奠定坚实基础。因此,本研究分为三个部分,第一部分通过对近红外光谱技术的运用和研究,来精确诊断烧伤创面皮肤坏死组织深度,提高对烧伤创面深度的诊断精度,不仅能为烧伤诊断提供新的更加精确的烧伤分类思路,还能为临床医生判断烧伤深度提供客观参考依据,提高烧伤创面愈合质量;第二部分,利用太赫兹射线对医用纱布中渗出液含量进行精确检测,以准确判断纱布中渗出液的具体含量,为临床换药时机的选择提供客观参考依据,一定程度上减少患者的痛苦并节省部分医疗和人力资源;第三部分,探索VIP-DA-PCL纳米纤维膜对在体小鼠创面愈合的影响及相关机制,为烧伤创面敷料的选择和制作提供一种新的思路,丰富同类型敷料促进创面愈合的理论基础,并为下一步临床转化奠定基础。第一部分:近红外光谱用于精确诊断烧伤创面坏死组织深度实验目的:明确烫伤深度与烫伤时间的关系;建立原始光谱数据与烫伤时间的对应关系;提取烧伤创面成份信息以及结构信息来表征烧伤皮肤的功能状态;获得烧伤深度反演模型以及该模型的准确率。实验内容和方法:①制作不同烫伤时间的猪皮烫伤模型,按照烫头接触皮肤时间依次递增分为九组:5s,10s,20s,30s,40s,60s,80s,100s,120s,每组制作5个样本。②打开光谱仪调节至数据采集状态。使烫伤创面与入射光纤保持垂直,光纤探头距探测表面2cm,对每个样品表面不同的四个部位进行光谱数据采集,并对每个部位多次测量,分类保存。③在采集光谱数据后对创面立即取材。进行HE染色,经组织学观察分别测量每个烫伤时间点对应的具体烫伤深度数值,每个标本测量五次,深度数值经两位独立的病理学工作者分别测量,取其平均值后得到。④将采集到的光谱信息数据进行分析并提取其光学特性参数。蒙特卡洛分析提取成份信息(脱氧血红蛋白,血红蛋白,水)以及结构信息(散射颗粒的大小和浓度)来表征烧伤皮肤的功能状态,构成特征参数集;⑤将得到的光学特性参数样本用于SVM训练,将1557个总样本分为两部分,第一部分为总样本的2/3 (1037个样本),用于构建和训练支持向量机模型,训练方式为交叉检验法,挖掘出光学特征与烧伤深度之间的线性或非线性关系,建立烧伤皮肤组织、成分结构及二者复合交互项与烧伤深度的复杂映射关系模型;然后通过第二部分为总样本的1/3 (520个样本),用该样本对模型进行10次反演,验证模型的效果并对所建模型的预测精度进行评价。实验结果:①建立了烫伤时间与烫伤深度之间的线性对应模型,在控制烫伤条件下,在1-120s的烫伤时间内,烫伤深度随烫伤时间的增加而单调递增。通过对标准差的分析可知,模型稳定可靠。②得到了原始近红外光谱数据与烫伤时间的对应关系,发现随着烫伤时间的增加,光谱曲线在特定波段(900-1300nm)的光谱幅值随着烫伤深度的增加逐渐降低,光谱曲线也逐渐趋于平滑。③提取得到含有五个参数的光学特征集,各参数本身有一定的规律性,但规律不明显。④成功利用SVM训练构建出烧伤深度反演模型,并对该模型进行10次反演,得到的平均相对误差均值为7.63%,诊断精度在百微米级。实验小结:近红外光谱能够测量得到烧伤皮肤坏死深度数据,然后利用蒙特卡洛参数提取方法和SVM参数训练的方法能够构建出烧伤深度反演模型,通过该模型能够从采集的近红外光谱数据中精确反演出烧伤创面的坏死组织具体深度数值,并且该模型反演的结果平均相对误差均值为7.63%,诊断精度在百微米级。第二部分:太赫兹光谱用于精确诊断纱布中渗出液含量实验目的:探索太赫兹光谱对纱布的穿透能力,明确太赫兹光谱用于探测纱布中渗出液含量的可行性;测量纱布中三种渗出液的太赫兹光谱,构建通过太赫兹光谱数据测量纱布中液体含量的模型,证实太赫兹光谱能够完成对纱布中渗出液含量的精确诊断。实验内容和方法:①将消毒后的医用纱布裁剪为5 ×5cm大小的方块,按照纱布层数依次次递增的方式分别准备共18组纱布,纱布层数从1层到80层,分别测量样品光和参考光;②通过公式推导并简化公式,得到THz波透过特性与纱布层数之间的线性关系;③准备新鲜的1000 ml猪血液样品,在样品中8%的柠檬酸钠的10ml,取其中的500 ml全血作为全血样本;剩下的500ml全血放入离心机按照2000rpm的转速离心30分钟,取其上清做为血浆样本;再从Milli-Q纯水仪中取蒸馏水500ml作为蒸馏水样本。分别滴加在事先准备好的大小为5×5 cm,层数为40层的医用纱布正中,滴加的液体总含量分别为,蒸馏水:0.1g、0.2g、0.3g、0.5g、0.7g、1g;血浆0.1g、0.2g、0.3g、0.4g、0.5g;全血:0.1g、0.2g、0.3g、0.4g、0.5g;对纱布中滴加的每种液体的每个含量利用太赫兹光谱系统进行测量,得到THz时域光谱图;④考虑实际液体蒸发带来的对纱布中滴加的液体总含量的影响,通过对纱布同步称重,修正实际滴加入纱布中液体含量,并建立实际递减液体含量与初始滴加液体含量之间的对应关系,通过简化实验模型与公式推导,得到纱布中样品液的总含量mfull与0.3T处THz反射率之间的对应模型。实验结果:①纱布层数的增加会带来太赫兹(THz)波的透过率的衰减和位相延迟的增加,THz波对纱布具有非常好的穿透性,到80层纱布仍然有信号穿过。②随着纱布中液体含量的增加,THz波的吸收率单调递增,三种液体的吸收性质不同,因此对应的液体拟合曲线的斜率不同,蒸馏水的斜率为0.1518,全血的为0.089,血浆的为0.0684。③测量蒸馏水的敏感度为1.3mg;测量全血的敏感度为0.76mg;测量血浆的敏感度为0.58mg。该结果的意义为,当纱布中蒸馏水的含量改变大于等于1.3mg的时候,就能被我们搭建的THz-TDS系统检测到,而用于检测全血和血浆时,这个检测的最小液体变化量分别为0.76mg和0.58mg。实验小结:太赫兹波对医用纱布具有良好的穿透性能,能十分精确的检测到纱布中三种渗出液(全血、血浆和水)的含量,并且这种水平的检测敏感度在1.3mg以内,远远高于如今临床仍然通过肉眼和经验得到的敏感度。第三部分:VIP-DA-PCL纳米纤维膜用于促进创面愈合的研究实验目的:将加载有血管活性肠肽-多巴胺微球的聚已内酯(VIP-DA-PCL)纳米纤维膜材料用于在体小鼠创面愈合的研究,明确该材料对创面愈合的影响;通过对创面组织中细胞增殖标志物定位和定量的检测,以及对血管生成标志物的定量检测,明确该材料对在体细胞增殖和血管再生的影响。实验内容和方法:①制作小鼠全层皮肤缺损模型,用直径4毫米打孔器在小鼠背部制作一个直径4mm的全层皮肤缺损创面。对于不同分组的老鼠分别使用灭菌的凡士林纱布、PCL-DA纳米纤维膜和PCL-DA-VIP纳米纤维膜分别覆盖在创面上,并在各组材料表面再覆盖一层负压生物膜固定。以仅覆盖负压生物膜的动物组为对照组。②创面愈合面积测量,我们在小鼠背部打孔手术后第1、3、5、7天分别对创面进行拍照,并用由两名独立的研究人员分别使用软件IPP 6.0对创面的愈合面积进行测量,然后取其平均值。③将小鼠在术后第3天处死,对全层缺损创面组织取材,制作切片并对切片进行HE染色后,使用光学显微镜进行拍照。再生上皮长度,由两名独立的研究者分别进行测量,然后取其平均值。④将小鼠在术后第3天和7天处死,对全层缺损创面组织取材,固定切片后,对切片进行马松三色染色后,使用光学显微镜进行拍照。肉芽组织厚度,由两名独立的研究者分别进行测量,然后取其平均值。⑤我们在打孔术后第3天用免疫组化检测了创面的细胞增殖标志物即增殖细胞核抗原(PCNA)的含量,并在显微镜下观察统计。⑥我们通过免疫印迹法(WB)在全层皮肤创面手术后3天对细胞增殖标记物PCNA、血管生成的标志物CD31以及血管内皮生长因子(VEGF)进行了定量检测。实验结果:①创面愈合速度:创面打孔术后第7天PCL-DA-VIP纳米纤维膜组创面愈合速度明显优于其余各组(p 0.05)。②新生上皮长度:在打孔术后第3天,PCL-DA纳米纤维膜组和PCL-DA-VIP纳米纤维膜组的新生表皮长度明显优于对照组和凡士林纱布组(p0.05)。然而,在PCL-DA纳米纤维膜组和PCL-DA-VIP纳米纤维膜组的新生表皮长度之间并未发现具有统计学意义的差异。③肉芽组织厚度结果:创面经马松三色染色后在打孔术后第3天和第7天在PCL-DA-VIP纳米纤维膜组的肉芽组织厚度明显优于其余组(p 0.01)。④细胞增殖情况:新生表皮中的PCNA的免疫组化染色结果,在PCL-DA纳米纤维膜组和PCL-DA-VIP纳米纤维膜组中PCNA阳性细胞数明显多于对照组(p0.05).然而,在PCL-DA纳米纤维膜组和PCL-DA-VIP纳米纤维膜组的新生表皮中PCNA阳性细胞数量之间并未发现具有统计学意义的差异。在皮肤全层中的包括新生表皮组织和肉芽组织中的PCNA蛋白免疫印迹结果中,PCL-DA-VIP纳米纤维膜组的PCNA条带光密度值明显高于其余组(p 0.001)。⑤血管再生标志物结果:对创面皮肤全层中的CD31和VEGF进行WB检测,PCL-DA-VIP纳米纤维膜组中CD31条带光密度值明显高于其余组(p 0.05). PCL-DA-VIP纳米纤维膜组中VEGF条带光密度值明显高于对照组和PCL-DA纳米纤维膜组(p 0.05)。然而,凡士林纱布组和PCL-DA-VIP纳米纤维膜组的中VEGF含量并未发现明显差异。实验小结:PCL-DA-VIP纳米纤维膜能促进在体创面的愈合,该膜具有促进肉芽组织生长和血管生成的作用,但是对创面的再上皮化无明显改善作用。总体结论:综合以上三方面的内容,通过在烧伤诊断和治疗方面的探索研究,我们得出以下结论:1.近红外光谱能够精确测量烧伤皮肤坏死深度数值,构建的烧伤深度反演该模型平均误差为7.63%,诊断精度在百微米级。2.太赫兹波对医用纱布具有良好的穿透性能,能十分精确的检测到纱布中三种渗出液(全血、血浆和水)的含量,并且这种水平的检测敏感度在1.3mg以内。3. PCL-DA-VIP纳米纤维膜能促进在体创面的愈合,该膜具有促进肉芽组织生长和血管生成的作用,但是对创面的再上皮化无明显改善作用。以上目标的实现,为烧伤的诊断和治疗提供了一些新思路,新方法,对相关层面上的机制的初步探索,也将为烧伤的精准医疗的发展,提供了一定的理论和数据支撑。
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R644
【图文】：

高亮度光源,光谱仪,工作台,器械技术

然后打开光源采集漫反射标准板的ＮＩＲ光谱，并设定其反射幅值为１００％，待逡逑工作５分钟稳定后，表示该光谱仪处于信号采集状态，准备好样品后，开始采集ＮＩＲ逡逑光谱信号。使用的采集装置如图１所示。逡逑图１配备高亮度光源、自制工作台和ＶＩＳ－ＮＩＲ光纤的ＮＩＲＱｕｅｓｔＮＩＲ光谱仪逡逑２．２烧伤模型建立逡逑２．２．１材料逡逑２．２．１．１主要实验仪器及相关耗材来源逡逑仪器耗材名称逦来源逡逑普通医用口罩逦重庆鼎国生物技术有限责任公司逡逑一次性手套逦重庆鼎国生物技术有限责任公司逡逑充电电推剪逦沃尔玛（重庆）购物广场有限公司逡逑双面刀片逦上海吉列责任有限公司逡逑无菌注射器（ｌｍｌ）逦上海康德莱股份有限公司逡逑眼科剪逦山东新华器械技术有限公司逡逑眼科镊逦山东新华器械技术有限公司逡逑手术刀逦山东新华器械技术有限公司逡逑２８逡逑

猪皮,表面接触,创面,时间变化

图２猪皮烫伤模型创面随烫伤时间变化图：逡逑左上角红色小字代表烫伤仪与猪皮表面接触时间，ｓ代表秒逡逑如图２所示，随着烫伤时间的增加，猪皮烫伤区域的颜色越来越深，边界越来越逡逑清晰，中间区域隆起越来越高。逡逑３６逡逑

距离线,猪皮,图片,坏死组织

ｓ代表秒；图片中黄色距离线之间的区间代表长度为具体坏死组织区域，距离线中间逡逑的黄色小字代表具体测量的深度数值。逡逑如图３所示，烫伤区可见坏死物附着，毛囊等皮肤附属器坏死，真皮层胶原纤维逡逑排列紊乱，血管扩张、淤血，烫伤交界区可见数量不等的多形核粒和单个核细胞浸润。逡逑３７逡逑

【参考文献】