脑源性微粒激活小胶质细胞在脑外伤后神经炎症反应中作用的研究

发布时间：2020-09-15 20:04

　　研究目的:创伤性颅脑损伤(traumatic brain injury,TBI)不是单一的病理、生理过程,主要包括原发性和继发性损伤过程,共同导致了神经结构的破坏和功能的受损。继发性神经炎症反应是TBI后重要的继发性病理生理反应,在继发性脑损伤中发挥了重要作用。小胶质细胞作为中枢神经最重要的固有免疫细胞和主要的效应细胞,在TBI后继发性炎症反应中发挥关键性作用。更好的理解小胶质细胞表型转变的调节机制可以提高我们对TBI后神经损伤及修复的认识,并为TBI的新治疗策略的开发提供机会。但小胶质细胞激活、分化的分子调控机制极为复杂,具体机制尚不清楚。细胞微粒(Microparticles,MPs)是一类介于0.1到1?μm大小的小细胞囊泡,它们含有多种生物活性分子,包括蛋白质、生物脂类和核酸,穿梭于细胞间发挥递质作用,是导致机体产生相关炎症反应的重要介质。由于脑组织细胞膜的磷脂结构较体内其它细胞更高,因此脑组织来源的MPs(Brain-derived Microparticles,BDMPs)的促炎活性可能比血细胞源性的MPs要更高。然而BDMPs的分子生物学特点尚不十分清楚,未见其在TBI后的继发性炎症反应中作用的相关研究报道。因此,本课题借助小鼠脑皮层下注射模型及体外小胶质细胞,观察BDMPs对小胶质细胞激活的影响及相关炎性反应,探索BDMPs通过介导小胶质细胞在TBI后继发性炎症反应中的作用及其机制。研究方法(1)建立小鼠液压打击脑外伤(TBI)模型,使用酶消化梯度离心法从TBI后脑损伤区提取BDMPs,应用应用流式细胞术对TBI后脑损伤区BDMPs进行表型鉴定以及成分分析;(2)借助小鼠大脑皮层下注射模型,免疫荧光染色观察小鼠脑注射区的小胶质细胞激活情况,采用免疫组化染色观察其激活,增殖以及分化(M1/M2)情况,应用RT-PCR法检测组织中炎症因子TNF-α、IL-6、IL-l0及单核细胞趋化因子-1(MCP-1)的RNA含量;(3)将BDMPs与小胶质细胞(BV2)中共培养,应用离子电导显微镜动态观察小胶质细胞的激活和形变情况,应用western-blot和ELISA技术检测小胶质细胞中炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-l0及单核细胞趋化因子(MCP-1/CCL-2)的含量变化。(4)借助小鼠大脑皮层下注射模型,通过伊文思蓝注射观察血脑屏障破坏情况,干湿重法对比脑水肿程度。体外培养人脐静脉内皮细胞(HUVEC)模拟脑血管屏障,加入BDMPs干预,观察HUVEC屏障的通透性变化。研究结果(1)BDMPs表达数量不等的生物标记物(NSE和GFAP),进一步发现BDMPs是由多细胞源性MPs构成,以神经元性及胶质细胞源性MPs为主,还含有血细胞及内皮细胞来源MPs;(2)小鼠脑皮层下注射区的小胶质细胞被BDMPs广泛激活,形态由分支样向球形转化,并出现M1/M2表型的动态分化。PCR结果显示脑组织中炎症因子IL-1β,TNF-a,IL-6,单核细胞趋化因子CCL2和NOS2的mRNA增多;(3)体外实验中小胶质细胞与BDMPs共培养52分钟后开始发生形变,104分钟后完全激活形变。3小时后,小胶质细胞结合并吞噬BDMPs,细胞裂解液中IL-6,TNF-α和MCP-1水平显著升高,上清液ELISA实验提示TNF-α和MCP-1水平增高,但IL-10水平均无显著变化;(4)BDMPs注射后小鼠脑组织表面可见明显水肿,依文思蓝渗漏现象也比较严重。体外加入BDMPs悬液时,HUVEC屏障对FITC-Dextran的渗漏显著增加;研究结论(1)BDMPs可以结合并介导小胶质细胞的激活、形变以及分化,促进TNF-α、IL-1β、IL-6等多种炎性因子以及单核细胞趋化因子MCP-1/CCL-2高表达,在TBI后的继发性炎症反应中发挥促炎作用。(2)BDMPs可以增加BBB的通透性,加重脑水肿。
【学位单位】：天津医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R651.15
【部分图文】：

区域图,流式细胞仪,微粒,直径

天津医科大学博士学位论文13图1.1 流式细胞仪鉴定BDMPs A: 根据Megamix标准微粒确定MPs的位置；B:圈选直径＜0.9 μm的P1区域，即为MPs；C：以APC-Annexin V+EDTA和NSE/GFAP的IgG为对照，圈选Q2-5二者双阳性区域，即为BDMP（sAnnexin V+ NSE/GFAP）。1.2.2 BDMPs中的各种细胞MPs含量分析选取P2区域的BDMPs进一步鉴别各种细胞来源MPs的含量，进入上述各种荧光标记的峰状图（与各自-IgG为同型对照）：神经细胞来源MPs：（FITC-NSE）阳性率为43.2±11.4％（图1.2A）胶质细胞来源MPs：（FITC-GFAP）阳性率为36

阳性率,来源

荧光标记的峰状图（与各自-IgG为同型对照）：神经细胞来源MPs：（FITC-NSE）阳性率为43.2±11.4％（图1.2A）胶质细胞来源MPs：（FITC-GFAP）阳性率为36.8±10.3％（图1.2B）血小板来源MPs：（FITC-CD42b）阳性率为3.1±0.9％（图1.2C）白细胞来源MPs：（PE-Cy7-CD45）阳性率为2.3±0.9％（图1.2D）内皮细胞来源MPs：（Fluor 450-CD144）阳性率为1.5±0.3％（图1.2E）红细胞来源MPs：（APC-CD235）阳性率为3.8±0.8％（图1.2F）

模式图,皮层下,小鼠,模式图

天津医科大学博士学位论文比较采用SNK法。统计分析采用SPSS 18.0，P＜0.05有统计学差异。2 结果.1 小鼠皮层下注射模型的建立将提前制备好的 BDMPs 与上清液 1:1 稀释制成 BDMPs 悬液，大约06BDMPs/10ul，通过立体定向装置，利用 10ul 微量注射器，将 10ulBD注入到小鼠的皮层下接近基底节位置，前期对 BDMPs 悬液的浓度和注行了预实验，发现 10ul，1:1 稀释浓度的 BDMPs 悬液既能在小鼠皮层明显的损伤区域，并且建模过程中小鼠也有较高的生存率。为了排除小胶质细胞和炎性反应的影响，设置 10ul 上清液皮层下注射对照组以组。相对于研究 TBI 模型中 BDMPs 的作用机制，单独皮层下注射 BD有助于规避 TBI 后脑损伤区复杂的干扰因素的影响。如图 2.1

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