PPAR-γ受体介导的小胶质细胞向M2亚型极化对颅脑创伤预后的影响

发布时间：2020-09-16 15:28

　　 颅脑创伤(TBI)是威胁人类健康的主要疾病之一,目前仍无特效的治疗措施。颅脑创伤的病理过程分为原发伤和继发伤,原发性损伤发生在损伤即刻,无法进行干预,而继发性损伤发生在损伤之后数分钟至数周,由多种细胞因子和炎症因子介导,可以进行干预。越来越多的研究表明小胶质细胞介导的炎症反应在继发性颅脑损伤中起着重要作用。目前文献将激活的小胶质细胞分为两种亚型:M1型,具有促炎作用,M2型,具有抑炎作用。通过抑制小胶质细胞向M1型极化,促进其向M2型极化已经在多种中枢神经系统疾病动物模型中显示出神经保护作用。然而,抑制小胶质细胞向M1极化,促使其向M2型极化对颅脑创伤的作用及机制仍无相关报道。在本研究中我们结合体内、外实验研究调控小胶质细胞向M2亚型极化对神经炎症反应、轴索损伤以及颅脑创伤神经功能预后的影响,为开发颅脑创伤治疗的潜在新方法提供新思路。本研究分为三个部分:第一部分:小鼠原代小胶质细胞的分离、培养和鉴定;第二部分:体外实验研究PPAR-γ激动剂调控小胶质细胞向M2型极化对LPS刺激后神经炎症反应的影响;第三部分:动物实验研究研究PPAR-γ激动剂调控小胶质细胞向M2型极化对颅脑创伤预后的影响。第一部分 小鼠原代小胶质细胞的分离、培养和鉴定目的:利用新生小鼠分离、培养小鼠原代小胶质细胞,评估原代小胶质细胞的纯度,为进一步开展体外实验研究调控小胶质细胞极化亚型对炎症反应的影响奠定基础。方法:利用新生的C57BL/6小鼠(1-2d),无菌条件下断头、取脑,显微镜下分离大脑皮层。切碎、消化、离心、重悬,将细胞接种于多聚赖氨酸包被的培养瓶中,原代混合胶质细胞培养至第9天,细胞出现明显分层生长,待细胞完全分层2天后进行摇床震摇分离,然后利用Iba-1免疫荧光检测。结果:在倒置相差显微镜下可观察到混和胶质细胞长满瓶底,并出现明显的细胞分层现象,底层为扁平、多种形状的、具有多个突起的星型胶质细胞,上层细胞呈偏小、类圆形、折光性强,附着于星型胶质细胞表面生长,为小胶质细胞。静息状态的小胶质细胞表现为胞体较小,具有分支状突起,而激活状态的小胶质呈现圆形或椭圆形。Iba-1免疫荧光鉴定小胶质细胞纯度92.58%。结论:原代分离、培养的小胶质细胞纯度较高,可用于进一步开展体外实验研究小胶质细胞极化亚型调控对神经炎症反应的影响。第二部分 体外实验研究PPAR-γ受体介导小胶质细胞向M2亚型极化对神经炎症反应的影响目的:通过体外实验研究调控小胶质细胞向M2型极化对LPS刺激后小胶质细胞介导的神经炎症反应的影响。方法:构建小胶质细胞培养体系,并将其分为以下实验组:小胶质细胞组,小胶质细胞+LPS组,小胶质细胞+LPS+罗格列酮(PPAR-丫激动剂)组,小胶质细胞+LPS+GW9662(PPAR-y拮抗剂)组。利用 ELISA 检测炎症因子 TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10表达水平,PCR检测小胶质细胞极化标志物M1型(CD16/32,CD86),M2型(CD206,Ym-1)表达水平以鉴定小胶质极化亚型改变。结果:相比于对照小胶质细胞,LPS刺激后小胶质细胞M1亚型标志物表达水平升高,M2亚型标志物表达下降,炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10表达显著升高。相比于LPS刺激组,罗格列酮处理组小胶质细胞M1型标志物表达水平降低,M2型标志物表达升高,同时炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10表达水平显著降低,GW9662处理组小胶质细胞M1型标志物表达升高,M2型标志物表达下降,同时炎症因子表达水平升高。结论:LPS处理后小胶质细胞向M1亚型极化增强,伴随炎症因子表达上调,利用罗格列酮调控小胶质细胞向M2型极化可以降低LPS刺激后小胶质细胞炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10表达,减轻炎症反应。第三部分 动物实验研究PPAR-γ受体介导小胶质细胞向M2亚型极化对颅脑创伤预后的影响目的:通过动物实验研究调控小胶质细胞向M2亚型极化对颅脑创伤后神经炎症反应、轴索损伤以及神经功能预后的影响。方法:利用C57BL/6小鼠构建液压损伤的颅脑创伤模型,并将小鼠分为以下实验组:假手术组,颅脑创伤组,颅脑创伤+罗格列酮(PPAR-γ激动剂),颅脑创伤+GW9662组(PPAR-γ拮抗剂)。利用NSS评分评估小鼠TBI后的神经功能预后,ELISA检测小鼠脑皮层中炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10表达水平,镀银染色以及β-APP免疫组化检测小鼠皮层中轴索损伤情况,qRT-PCR检测小胶质细胞极化标志物M1型(CD16/32,CD86),M2型(CD206,Ym-1)表达水平,免疫荧光检测小胶质细胞极化表型。结果:相比假手术组小鼠,颅脑创伤后小鼠脑组织中小胶质细胞M1亚型标志物表达水平升高,M2亚型标志物表达下降,炎症因子TNF-αα、IL-1β、IL-6和IL-10表达显著升高,轴索损伤指标β-APP显著升高。相比于TBI组小鼠,罗格列酮处理组的小鼠小胶质细胞M1型标志物表达水平降低,M2型标志物表达升高,同时炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10表达水平显著降低,轴索损伤指标β-APP显著降低,NSS评分降低。相比于TBI组小鼠,GW9662处理组小鼠小胶质细胞M1型标志物表达水平升高,M2型标志物表达降低,同时炎症因子表达水平上升,轴索损伤指标β-APP也显著升高,NSS评分升高。结论:颅脑创伤后小胶质细胞向M1型极化增强,伴有炎症因子表达上调。利用罗格列酮(PPAR-γ激动剂)调控小胶质细胞向M2型极化可以减轻颅脑创伤后脑皮层中炎症反应,减轻轴索损伤情况,改善神经功能预后。
【学位单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R651.15
【部分图文】：

４．２原代小胶质细胞Ｉｂａ－１免疫荧光鉴定逡逑小胶质细胞特异性抗体丨ｂａ－１免疫荧光鉴定结果显示，绝大部分分离培养的细逡逑胞Ｉｂａ－１表徶阳性，阳性率平均为９２．５８％，表明小胶质细胞分离成功。图１．１是逡逑小胶质细胞Ｉｂａ－１免疫荧光鉴定结果，红色荧光为Ｉｂａ－１阳性细胞，蓝色为ＤＡＰＩ逡逑核染色阳性。逡逑图１．１小胶质细胞Ｉｂａ－１免疫荧光鉴定：红色荧光为Ｉｂａ－１阳性细胞，蓝色为ＤＡＰＩ逡逑核染色阳性。逡逑９逡逑

本研究中我们通过激活或抑制ＰＰＡＲ－ｙ受体调控小胶质细胞的极化亚型改变，逡逑实验中利用Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ检测ＰＰＡＲ－丫蛋白表达水平以反映各组细胞处理后ＰＰＡＲ－ｙ逡逑受体激活情况。图２．１分别是各组细胞中ＰＰＡＲ－Ｙ表达条带（Ａ）和各组细胞中逡逑ＰＰＡＲ－ｙ蛋白相对表达水平（Ｂ）。研究结果显示，相比对照组小鼠，ＬＰＳ刺激后小逡逑胶质细胞中ＰＰＡＲ－ｙ表徶水平显著降低（ｐ＜0．0１）。相比ＬＰＳ处理组，ＬＰＳ邋＋ＰＰＡＲ－Ｙ逡逑激动剂罗格列酮处理组小胶质细胞中ＰＰＡＲ－ｙ蛋白表达水平显著升高（ｐ＜０．０１），逡逑ＬＰＳ邋＋邋ＰＰＡＲ－ｙ抑制剂ＧＷ９６６２处理组小胶质细胞中ＰＰＡＲ－ｙ蛋白表达水平降低（ｐ＜逡逑０．０１）。结果表明，ＬＰＳ刺激可以抑制小胶质细胞中ＰＰＡＲ－ｙ蛋白表达，罗格列酮和逡逑ＧＷ９６６２可以有效的上调或抑制小胶质细胞中ＰＰＡＲ－ｙ表达。逡逑Ａ邋ｃ，５ｌ逡逑ｏ逦＊＊逦姦Ｉ邋Ｃｏｎｔｒｏｌ逡逑ｌ，ｃ逦＊＊逦￣逦■逦－？邋ＬＰＳ逡逑２＊逦１．０－逦■■邋ＬＰＳ＋Ｒｏｓｉｇｌｉｔａｚｏｉｒ？逡逑＾邋＾逦ＩＨ｜逦ＬＰＳ＋ＧＷ９６６２逡逑Ｐｉｌｌ邋ｉｌｌ逡逑ｙ逦？逡逑／邋／逡逑Ｂ邋／邋＾邋／邋／逡逑ＰＰＡＲｙ邋－ｍｍｍｍｍｒｎ－邋，栥逦ｒｎｍｍｍｍｍ逦栜逡逑图２．１邋Ｗｅｓｔｅｍ－ｂｌｏｔ检测各组细胞中ＰＰＡＲ－Ｙ蛋白表徸情况逡逑图２．１分别是各组细胞中ＰＰＡＲ－ｙ蛋白检测条带（Ａ）和相对表达水平（Ｂ）。结果逡逑显示

研究中我们通过检测小胶质细胞表面标志物的ｍＲＮＡ水平来判定小胶质细胞逡逑极化亚型。ＣＤ１６、ＣＤ８６为Ｍｌ亚型小肢质细胞标志分子，ＣＤ２０６、ＹＭ－１为Ｍ２逡逑亚型小肢质细胞标志分子。图２．２－图２．５分别是各组小胶质细胞中ＣＤ１６、ＣＤ８６、逡逑ＣＤ２０６和ＹＭ－ｌｍＲＮＡ相对表达水平。结果显示，相比于对照组细胞，ＬＰＳ刺激逡逑后小胶质细胞中ＣＤ１６、ＣＤ８６ｍＲＮＡ相对表徸水平均显著升高（ｐ＜０．０１），邋ＣＤ２０６逡逑和ＹＭ－ｌｍＲＮＡ相对表达水平均显著降低（ｐ＜０．０１）。相比于ＬＰＳ刺激组，ＬＰＳ邋＋逡逑ＰＰＡＲ－ｙ激动剂罗格列酮组小胶质细胞中ＣＤ１６、ＣＤ８６ｍＲＮＡ相对表达水平均显著逡逑降低（ｐ＜邋０．０１，ｐ邋＜０．０５），ＣＤ２０６和ＹＭ－ｌｍＲＮＡ相对表达水平均显著升高（ｐ＜逡逑０．０５）。相比于ＬＰＳ组，ＬＰＳ邋＋邋ＰＰＡＲ－ｙ拮抗剂ＧＷ９６６２组小胶质细胞中ＣＤ１６、ＣＤ８６逡逑ｍＲＮＡ相对表达水显著升高（ｐ＜邋０．０５），ＣＤ２０６和ＹＭ－ｌｍＲＮＡ相对表达水平显逡逑著降低（ｐ＜０．０５）。该研究结果表明，ＬＰＳ损伤刺激可促使小胶质细胞向Ｍｌ亚型逡逑极化

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本文编号：2820026