脐带间充质干细胞治疗颅脑创伤的疗效与机制研究

发布时间：2020-11-15 09:28

　　 间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC),是来源于胚胎早期中胚层的一类多能成体干细胞。绝大多数的中枢神经系统疾病,如颅脑创伤(traumatic brain injury,TBI),脊髓损伤、脑卒中、神经系统变性疾病,主要的发病原因或发病机理为神经细胞的变性、凋亡、损伤或死亡。神经细胞的及时、有效的补充对神经系统疾病的预防和治疗尤为重要。当前基础和临床研究均显示,MSC具有向神经系统细胞分化的潜能,可以向受损的神经组织中迁移、归巢、生存、增殖和向神经细胞分化成为神经样细胞,为TBI的治疗提供“种子细胞”,从而改善患者的神经系统功能,改善患者生存状态和预后。因MSC本身免疫原性极低,在神经系统可视为免疫豁免,因此其可作为一种理想的“种子细胞”干预TBI,提高患者的生存质量。脐带来源广、变废为宝,本研究所选择的MSC为人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUC-MSCs)。本研究的目的是为了探讨hUC-MSCs移植治疗TBI的疗效、作用机制、安全性以及蛋白质组学变化情况,为hUC-MSCs临床治疗TBI提供理论支持和临床经验。本研究中将45只雄性SD大鼠随机分为3组:对照组、TBI模型组以及TBI干细胞治疗组,每组15只,利用电子大脑皮质挫伤撞击仪建立TBI大鼠模型,TBI干细胞治疗组大鼠经尾静脉给予0.1ml hUC-MSCs悬液和0.1ml生理盐水,对照组及TBI模型组给予0.2ml生理盐水,利用PCR、Western Blot、免疫组化以及ELISA检测,分别检测脑组织中和血清中白细胞介素-12(interleukin-12,IL-12)及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)的表达情况,并进行比较,发现TBI干细胞治疗组脑组织中IL-12 mRNA和蛋白表达水平明显下调,SOD mRNA和蛋白表达水平明显上调,血清中IL-12浓度显著降低,免疫组化结果也证实了脑组织中SOD表达水平上调。为了验证hUC-MSCs移植治疗TBI的疗效、细胞移植方式和安全性,本研究通过回顾性分析原武警后勤学院附属医院神经重症科自2015年4月至2015年11月收治的24例重型TBI患者的临床资料,分为常规治疗组和hUC-MSCs治疗组,比较常规治疗组与hUC-MSCs治疗组患者性别、年龄、致伤原因等基本临床资料,比较两组患者入院时、伤后1个月及3个月GCS评分,比较两组患者住院时间及伤后6个月GOS评分,观察hUC-MSCs治疗组不良反应事件,发现hUC-MSCs治疗组在伤后3个月GCS评分、伤后6个月GOS评分以及住院时间均显著优于常规治疗组,移植治疗期间以及后期的随访过程中,无明显不良事件发生。为了更深层次探讨hUC-MSCs治疗急性TBI的分子机制,本研究采用数据非依赖采集技术进行数据采集,对经hUC-MSCs治疗前后的脑脊液进行生物信息学处理,经过严格的定量多肽以及子离子筛选,本实验共鉴定到722个蛋白,其中对633个蛋白进行了可靠的定量分析,筛选到hUC-MSCs治疗前后发生改变的42种差异蛋白,其中上调蛋白有29种,下调的蛋白有13种,主要包括白介素(IL-6、IL-12)、神经穿透素、过氧化物酶、神经生长因子等。对筛选到的差异蛋白进行GO分析、KEGG Pathway分析、蛋白质相互作用网络图分析以及聚类分析,发现这些差异蛋白的改变主要表现在对应激反应调节、免疫调节、轴突重塑以及血管重建方面。经本实验研究证明:hUC-MSCs移植后,通过下调IL-12,控制炎症反应;同时通过上调SOD,有效的抑制氧化应激反应,减少对受损脑组织的二次伤害;hUC-MSCs移植治疗重型TBI,可改善患者预后,缩短住院时间;多次、多途径、序贯式的hUC-MSCs移植治疗TBI是一种行之有效且安全性高的治疗方法;hUC-MSCs移植治疗TBI的作用机理可能为改善应激反应、进行免疫调节、改善机体微环境、促进轴突再生重塑以及血管再生重建;通过细胞替代治疗与“伪旁观者作用”共同发挥作用,在一定程度上修复损伤脑组织形态结构,同时通过旁分泌或自分泌作用分泌具有生物活性的物质,促进恢复神经系统功能。
【学位单位】：天津医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R651.15
【文章目录】：
中文摘要
Abstract
缩略语/符号说明
前言
    研究现状、成果
    研究目的、方法
一、hUC-MSCs移植对急性TBI大鼠超氧化物歧化酶及白细胞介素-12 的影响
    1.1 材料与方法
        1.1.1 hUC-MSCs的分离、培养及质量控制
        1.1.2 TBI模型的建立
        1.1.3 干预及检测
        1.1.4 RT-PCR检测脑组织中IL-12及SOD的 mRNA的变化
        1.1.5 Western Blot检测脑组织中IL-12及SOD蛋白的变化
        1.1.6 免疫组化
        1.1.7 血清IL-12 的测定
        1.1.8 统计学处理
    1.2 结果
        1.2.1 IL-12及SOD mRNA的表达情况
        1.2.2 IL-12及SOD蛋白水平的表达情况
        1.2.3 各组脑组织SOD表达的差异情况（免疫组化）
        1.2.4 各组血清中IL-12 浓度差异情况（ELISA检测）
    1.3 讨论
    1.4 小结
二、hUC-MSCs移植治疗急性TBI的临床研究
    2.1 资料与方法
        2.1.1 临床资料
        2.1.2 治疗方法
        2.1.3 hUC-MSCs的分离、培养、质量控制和移植
        2.1.4 观察指标
        2.1.5 统计学方法
    2.2 结果
        2.2.1 hUC-MSCs形态观察
        2.2.2 流式细胞术检测hUC-MSCs单细胞悬液表面标志物
        2.2.3 两组患者基本临床资料对比
        2.2.4 两组患者治疗后GCS评分及GOS评分对比
        2.2.5 两组患者住院时间对比以及不良反应事件
        2.2.6 典型病例
    2.3 讨论
    2.4 小结
三、TBI患者经hUC-MSCs治疗后脑脊液蛋白组学的变化
    3.1 对象和方法
        3.1.1 样本信息
        3.1.2 样本分组及处理
        3.1.3 CSF蛋白提取与处理
        3.1.4 液相-串联质谱法（liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS）检测
        3.1.5 DDA数据采集——数据库构建
        3.1.6 DIA数据采集——定量数据采集
        3.1.7 DIA定量分析
        3.1.8 主要数据指标
    3.2 结果
        3.2.1 谱图库构建
        3.2.2 数据质量评估
        3.2.3 定量多肽与子离子挑选
        3.2.4 定量分析
        3.2.5 GO分析
        3.2.6 KEGG分析
        3.2.7 蛋白之间的相互作用
        3.2.8 聚类分析
        3.2.9 差异蛋白表达
    3.3 讨论
    3.4 小结
全文结论
论文创新点
参考文献
发表论文和参加科研情况说明
综述 间充质干细胞研究与应用进展
    综述参考文献
致谢
个人简历

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本文编号：2884610