脓毒症急性肺损伤时HSPA12B对肺血管通透性的影响及其机制

发布时间：2017-06-24 08:18

  本文关键词：脓毒症急性肺损伤时HSPA12B对肺血管通透性的影响及其机制，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：脓毒症是临床上常见的、严重威胁病人生命的感染性综合征,进一步发展导致脓毒症休克、多器官功能损伤,发病率及死亡率高。其中,急性肺损伤(ALI)是脓毒症最常见的并发症之一,其发生发展的关键机制是肺内皮屏障功能障碍,肺血管通透性增加,进一步导致肺水肿、严重低氧血症。肺血管通透性增加是其主要的病理生理特征。因此,保护肺血管内皮细胞、维持正常的肺内皮屏障功能及肺血管通透性对于ALI的干预治疗具有重要的临床意义。热休克蛋白A12B(HSPA12B)是HSP70超家族中的一员,不同于其他热休克蛋白,它主要表达于血管内皮细胞,是内皮细胞特异的热休克蛋白,参与了血管的生成与稳定。HSPA12B表达上调可以减轻脓毒症导致的心功能障碍,也可以减轻缺血再灌注时脑组织的损伤。但是,HSPA12B对脓毒症时肺脏功能有无保护作用,尤其是对肺内皮通透性有无影响及其可能的机制,尚未见研究。本研究通过离体与在体两大部分实验,探讨脓毒症时HSPA12B对内皮细胞通透性的影响及其可能的机制。离体实验,我们采用脂多糖(LPS)刺激人脐静脉内皮细胞(HUVEC),研究HSPA12B的表达变化情况及其发生变化的可能机制;构建HSPA12B高表达质粒,研究HSPA12B高表达对内皮细胞通透性的影响以及其作用机制。在体实验,我们构建CLP小鼠模型,观察HSPA12B表达下调对脓毒症小鼠肺通透性的影响。第一部分LPS处理HUVEC时HSPA12B的表达变化及其可能机制目的探讨HSPA12B在LPS处理的HUVEC中的表达变化及其机制。方法1.培养HUVEC,用终浓度为1μg/ml的LPS刺激HUVEC,分别于0h、3h、6h、9h、12h、24h收集细胞,应用RT-PCR法及Western blot法分别检测HSPA12B的m RNA及蛋白质水平。2.培养HUVEC,分别用NF-κB、p38抑制剂(NF-κB inhibitor、SB203580)及其对照试剂DMSO对细胞进行预处理,然后用LPS刺激HUVEC,12h后收集细胞,Western blot法检测HSPA12B的蛋白质水平。结果1.LPS处理HUVEC后,HSPA12B m RNA和蛋白质水平均在0-12h内逐渐升高,12h达高峰。2.与DMSO相比,使用NF-κB inhibitor、SB203580后可以降低LPS诱导的HSPA12B的蛋白质表达水平。结论内毒素对HUVEC中HSPA12B表达具有一定影响,HSPA12B的表达在0-12h内逐渐升高,12h达高峰,随后开始下降;LPS诱导的HSPA12B表达的改变与NF-κB、p38信号通路相关。第二部分HSPA12B对LPS诱导HUVEC通透性改变的影响目的研究HSPA12B表达上调对LPS诱导的HUVEC通透性改变的影响。方法HUVEC分为4组:①control组(未进行任何处理);②LPS(1μg/ml)组;③LPS+HSPA12B高表达组(转染质粒p IRES2-EGFP-3Flag-HSPA12B);④LPS+阴性对照质粒组(转染p IRES2-EGFP-3Flag)。分别进行相应的处理后,检测HUVEC的跨内皮电阻抗(TEER)值。结果control组、LPS组、(LPS+HSPA12B高表达)组、(LPS+阴性对照质粒)组的TEER值分别为:36±2?、25±1?、28±1?、45±2?。与LPS组和(LPS+阴性对照质粒)组比较,HSPA12B高表达组的TEER值均明显升高(P0.001)。结论HSPA12B可以降低LPS刺激下HUVEC的通透性,可能对血管内皮屏障功能有保护作用。第三部分HSPA12B影响HUVEC通透性的可能机制目的探讨HSPA12B对LPS刺激下HUVEC通透性的影响机制。方法将HUVEC分为四组:①control组(未进行任何处理);②LPS(1μg/ml)组;③LPS+HSPA12B高表达组(转染质粒p IRES2-EGFP-3Flag-HSPA12B);④LPS+阴性对照质粒组(转染p IRES2-EGFP-3Flag)。LPS处理12h后收集细胞,Western blot法检测粘附分子VE-cadherin、ICAM-1、E-selectin的表达,以及通透性相关激酶MLC、SRC、cdc42的表达及其活性;免疫荧光检测VE-cadherin的表达水平。结果Western blot检测结果表明:HUVEC经LPS刺激12h后,与转染阴性对照质粒组相比,HSPA12B高表达组的粘附分子VE-cadherin表达水平明显上调;HSPA12B高表达组的激酶MLC、SRC、cdc42的表达也增强,而其活性形式P-MLC、P-SRC、P-CDC42水平并无差异。免疫荧光结果显示,HSPA12B高表达组的VE-cadherin水平也升高。结论结合第二部分的实验结果,本部分结果提示:LPS刺激下,HSAP12B可能通过上调粘附分子VE-cadherin的表达,降低HUVEC的通透性;也可能通过增加血管内皮通透性相关的激酶MLC、SRC、CDC42的表达,降低HUVEC的通透性,从而起到保护血管内皮屏障功能的作用。第四部分HSPA12B对脓毒症肺损伤小鼠肺通透性的影响目的在体研究HSPA12B表达下调对脓毒症急性肺损伤小鼠肺通透性的影响。方法实验小鼠随机分为四组:sham组、CLP组、NC-CLP组、HSP12B-si RNA-CLP组。小鼠经鼻吸入修饰的si RNA纳米微粒复合物,CLP术后30h,经颈外静脉注射Evans Blue,2h后取肺组织检测EB染料的含量。结果肺组织大体观显示:较NC-CLP组,HSPA12B-si RNA-CLP组小鼠肺组织明显变蓝。肺组织Evans蓝的含量检测结果显示,sham组、CLP组、NC-CLP组、HSP12B-si RNA-CLP组小鼠肺组织EBD的含量分别为:10.28±0.72μg/g、12.22±0.37μg/g、11.97±0.79μg/g、15.65±2.36μg/g。与NC-CLP组相比,HSPA12B-si RNA-CLP组小鼠肺组织Evans蓝的含量明显增多(P0.001)结论HSPA12B表达下调后小鼠肺组织Evans蓝含量明显增多,表明肺通透性增加,肺血屏障功能受损。提示:脓毒症急性肺损伤时,HSPA12B高表达可能可以降低肺通透性,保护肺血屏障功能。
【关键词】：热休克蛋白A12B 脐静脉内皮细胞 脂多糖 NF-κB p38 热休克蛋白A12B 脐静脉内皮细胞 脂多糖 跨内皮电阻抗 热休克蛋白A12B 内皮通透性 粘附分子 激酶 热休克蛋白A12B 脓毒症急性肺损伤 肺通透性
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R459.7;R563

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本文编号：477589