常氧和低氧条件下的骨髓间充质干细胞培养上清液减轻机械通气造成的大鼠急性肺损伤

发布时间：2017-06-27 06:07

  本文关键词：常氧和低氧条件下的骨髓间充质干细胞培养上清液减轻机械通气造成的大鼠急性肺损伤，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：研究背景： 急性肺损伤（acutelunginjury,ALI）是肺内外多种致病因素导致的肺泡-毛细血管膜弥漫性损伤，肺组织充血、水肿的急性病理过程，发展至严重阶段为急性呼吸窘迫综合症（acuterespiratorydistresssyndrome,ARDS）。ARDS严重影响肺脏气体交换功能，临床表现为进行性呼吸困难和顽固低氧血症，死亡率高达40%以上。其发病机制尚未完全阐明，目前认为，炎症反应-抗炎反应失衡是ALI/ARDS发生发展最重要的病理生理机制。近年来对ALI/ARDS的治疗药物和措施进行了大量研究，业已证实呼吸支持治疗仍是当前的主要救治手段，治疗药物的研究尚未取得突破性进展。 骨髓间充质干细胞（marrow-derivedmesenchymalstemcells，MSCs）是一类具有不同的自我更新能力和多向分化潜能的未分化细胞，归巢到肺脏损伤部位后可分化为肺内多种细胞参与修复。无论是气管内滴注MSCs还是外源性输注MSCs都可以减轻机械通气导致的大鼠肺损伤。MSCs在ALI动物模型中取得了理想的治疗效果，但是其机制尚未完全明确。MSCs作为全细胞疗法治疗肺损伤对于病人可能存在一些风险，并且更多研究表明，MSCs并非主要通过多向分化为肺细胞发挥作用，因为在恢复的肺脏中很少能找到MSCs来源的肺细胞，说明分化成肺细胞的MSC所占比例很小。还有研究表明经过低氧刺激后的骨髓间充质干细胞浓缩培养液（MSC-derivedconditionedmedium，MSCsCM）同样能够促进肺损伤组织的修复，这种作用可能与角质细胞生长因子（Keratinocytegrowthfactor，KGF）的分泌增加有关，因此探讨MSCsCM及低氧刺激后的MSCsCM(H+MSCsCM)是否具有同样治疗作用是很有意义的工作。本研究利用机械通气造成肺损伤大鼠模型，观察了MSCsCM以及(H+MSCsCM)对肺损伤的治疗作用并初步探讨了其机制。 研究目的： 观察MSCsCM以及(H+MSCsCM)对肺损伤的治疗作用并初步探讨其机制。 实验方法： 一、骨髓间充质干细胞的体外培养和低氧对于骨髓间充质干细胞增殖作用的影响： （1）骨髓干细胞的收集培养：成年的雄性SD大鼠断颈处死SD大鼠后于75%酒精中浸泡5min。用全骨髓贴壁法培养细胞，选取生长状态良好的3代内细胞进行鉴定。 （2）收集MSCsCM及H+MSCsCM置4℃保存备用。 （3）以单克隆抗体CD45、CD90行流式细胞术鉴定大鼠骨髓间充质干细胞的。 （4）低氧对骨髓间充质干细胞的影响：用MTT法测定第3代MSCs细胞以及低氧处理的P3代（H+P3）细胞的增殖情况。 二、骨髓间充质干细胞培养上清液对于大潮气量机械通气导致的大鼠肺损伤的治疗作用： （1）VILI模型建立及动物分组：将雄性清洁级SD大鼠随机均分成：A组：空白对照组，B组：VILI组，C组：MSCsCM治疗组，D组：MSCsH+CM组。每组10只。大鼠自发呼吸30min后，B、C、D三组以呼吸频率80次/分、潮气量30ml/kg、呼气末正压（PEEP）0cmH2O参数进行机械通气3小时制备VILI模型。造模后即刻和之后21小时（即开始实验后24小时），A、B（阴、阳性）对照组经尾静脉输注PBS，C、D治疗组分别输注MSCsCM或者H+MSCsCM。 （2）肺损伤指标测定：开始实验48小时后处死大鼠，取大鼠左肺，测肺湿/干重比值（W/D）并观察组织病理学变化，检测肺组织匀浆中MPO值。 （3）肺损伤炎症因子及KGF表达量测定：制备并测定大鼠右肺支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolarlavagefluid，BALF）中蛋白含量、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-6（IL-6）、白介素-10（IL-10）以及角化蛋白生长因子（KGF）的表达水平。 三、MSCsCM及其H+MSCsCM对A549细胞系增殖和迁移能力的影响： （1）收集MSCs及H+MSCs，用荧光定量PCR法检测KGF的mRNA表达量。 （2）WST-1法测定上清液对A549肺泡上皮细胞的增殖影响。 （3）细胞划痕实验测定上清液对A549细胞迁移能力的影响。 实验结果： （1）用全骨髓贴壁法分离并培养SD大鼠骨髓MSCs细胞；流式细胞仪检测显示：第三代细胞表面MSCs特异性标志CD90表达率为96%，而非MSCs表面标志CD45仅为2.5%。MTT结果显示低氧培养下的MSCs比常氧条件下MSCs增殖速率高，并且光镜下观察到细胞状态均一和折光性更好。 （2）骨髓间充质干细胞培养上清液对于大潮气量机械通气导致的大鼠肺损伤的治疗作用：①成功复制VILI动物模型：病理检查发现，VILI组肺组织水肿并有大量炎性细胞浸润，而对照组肺组织结构接近正常；同时，VILI组大鼠左肺W/D比值、肺组织MPO值、肺泡灌洗液中蛋白含量、TNF-α和IL-6的表达均较对照组明显升高（P0.05）；在VILI组，肺泡灌洗液中的IL-10和KGF的表达也显著高于对照组（P0.05）。②MSCsCM和H+MSCsCM对VILI动物模型肺损伤的治疗作用：组织病理形态学研究发现，VILI组肺组织水肿并有大量的炎性细胞浸润，予MSCsCM和H+MSCsCM处理后可明显减轻肺组织炎症，肺组织结构接近正常；同时，，W/D比值MSCsCM组比VILI组降低14.1%，H+MSCsCM组比VILI组降低12.2%（P0.05）。VILI组与对照组相比，MPO活性明显增加（上升73.21%，P0.01），但MSCsCM组和H+MSCsCM组则较VILI组分别降低59.02%和63.14%（P均0.01）。肺泡灌洗液中蛋白含量MSCsCM组较VILI组降低0.23mg/ml（P0.01），H+MSCsCM组降低0.25mg/m（lP0.01）。③H+MSCsCM和MSCsCM对VILI动物模型BALF中IL-6、TNF-α和IL-10水平的影响：与VILI组相比，MSCsCM组IL-6和TNF-α分别降低了20.07%和34.74%（P均0.05），而H+MSCsCM组则分别降低了23.50%和37.11%（P均0.05）；MSCsCM组IL-10含量较VILI组升高21.16ng/ml，而H+MSCsCM组则升高18.79ng/ml（P均0.05）。④H+MSCsCM和MSCsCM对VILI动物模型肺中KGF的影响：MSCsCM组KGF比VILI组升高16.21pg/ml（P0.01），H+MSCsCM组则升高22.31pg/ml（P0.01）。 （3）体外实验结果显示：MSCsCM和H+MSCsCM均能促进A549细胞的增殖和迁移；低氧刺激MSCs之后KGF的mRNA的表达量增加了一倍（P0.05）。 结论： （1）用全骨髓贴壁法可以在体外分离、培养出纯度较高的SD大鼠来源MSCs，低氧环境可以刺激MSCs的增殖。 （2）MSCsCM和H+MSCsCM输注可以减轻VILI造成的肺部损伤和炎症细胞浸润； （3）MSCsCM和H+MSCsCM能促进肺泡上皮的增殖和迁移； （4）低氧可以刺激MSCs中KGFmRNA的表达。
【关键词】：骨髓间充质干细胞培养上清液 急性肺损伤 机械通气 角化细胞生长因子
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R563.8
【目录】：

• 缩略语表4-6
• 中文摘要6-10
• Abstract10-15
• 前言15-18
• 文献回顾18-29
• 实验一 大鼠骨髓间充质干细胞体外分离、培养鉴定及条件培养上清液的收集29-38
• 1 实验动物、材料与试剂29-31
• 2 实验方法31-32
• 3 实验结果32-35
• 4. 讨论35-38
• 实验二 常氧及低氧条件下骨髓间充质干细胞培养上清液对大鼠VILI治疗作用及机制初探38-59
• 1 实验动物、试剂与材料38-41
• 2 实验方法41-49
• 3 实验结果49-56
• 4 讨论56-59
• 小结59-60
• 参考文献60-72
• 个人简历和研究成果72-73
• 致谢73-74

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本文编号：488736