微小RNA在糖尿病创面中的差异表达及GM-CSF的干预作用

发布时间：2017-06-28 21:08

  本文关键词：微小RNA在糖尿病创面中的差异表达及GM-CSF的干预作用，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:观察糖尿病大鼠与正常大鼠皮肤创面组织微小RNA(miRNA)差异表达以及重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子(rhGM-CSF)凝胶对糖尿病大鼠创面愈合及微小RNA表达的影响,为进一步探讨糖尿病创面难愈合机制及其靶向治疗提供理论依据和实验基础。方法:(1)雄性清洁级SD大鼠,体重200~250g,一次性腹腔注射链脲佐菌素65mg/kg建立糖尿病大鼠模型。4周后取糖尿病成模大鼠及正常大鼠各6只于背部制备全层皮肤切除创面,造模3 d后手术切取上述创面组织。用Trizol抽提总RNA并质检,纯化后进行荧光标记、芯片杂交,然后扫描得到杂交图片。利用软件提取数据并行差异分析。实时定量RT-PCR验证芯片结果。(2)另取大鼠18只同前述方法建立糖尿病模型,4周后取其中稳定成模的16只糖尿病大鼠于背部两侧制作4个面积为(4.32±0.14)cm2全层皮肤缺损创面。采用配对设计、盲法、随机数字表法分为2组,揭盲显示A组为rhGM-CSF凝胶组、B组为外用型凝胶基质组。2组均每日涂布药膏1次,厚度为3 mm(rhGM-CSF实际作用量约为1μg/cm2),至伤后14 d。大体观察各组创面愈合情况,并于伤后3、7 d计算创面愈合率。伤后3、7、14 d,分别取1、2、4只糖尿病大鼠采集标本,行HE染色观察组织病理学改变,免疫组织化学染色检测创面CD31和PCNA表达。伤后7 d另取3只糖尿病大鼠采集组织样本,同前法行芯片检测并验证其结果。对差异表达明显的微小RNA行京都基因和基因组百科全书(KEGG)信号通路功能富集分析。对数据行配对样本t检验或两样本t检验。结果:(1)筛选出在糖尿病大鼠皮肤创面组织中上调的微小RNA有18个,下调65个。其中显著上调的微小RNA有大鼠-微小RNA-496-5p、大鼠-微小RNA-105、大鼠-微小RNA-122-5p等;显著下调的微小RNA有大鼠-微小RNA-196a-5p、大鼠-微小RNA-134-5p、大鼠-微小RNA-31-3p等。PCR的验证结果与与芯片检测结果接近。功能富集分析显示差异表达明显的miR-31、miR-222、miR-449a等微小RNA分别参与有丝分裂原激活蛋白激酶(MAPK)、Wnt、Notch等与创面修复相关的信号通路。(2)①伤后3 d两组创面肉芽组织增生明显,伤后7 d两组创腔均基本被肉芽组织填平(其中A组创面缩小更明显且肉芽组织量多),伤后14 d A组全部创面基本愈合而B组部分创面仍存在少许创腔及结痂。伤后3、7 d,A组创面愈合率分别为(41±5)%和(75±4)%均明显高于B组的(31±9)%和(71±4)%(P值均小于0.001)。②伤后3 d两组创面表皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞(Fb)等组织修复细胞均排列稀疏,有大量炎性细胞浸润(其中B组创面组织修复细胞及炎性细胞均较少)。伤后7 d两组创面内皮细胞、Fb排列渐致密,浸润的炎性细胞较前减少(其中A组创面组织修复细胞数量较B组多)。伤后14 d两组创面组织中内皮细胞、Fb细胞排列明显致密(其中A组表皮完全覆盖创面,B组部分创面仍有炎性浸润)。③伤后3、7 d两组创面肉芽组织中CD31和PCNA阳性表达均明显,伤后14 d表达均减弱。伤后3、7、14 d,A组创面CD31和PCNA阳性表达均较B组明显(P0.05)。④总RNA抽提及质检判定样本总量、纯度、完整性均符合实验要求。微小RNA芯片检测筛选,与B组比较A组创面组织中的微小RNA上调18个、下调13个。⑤实时定量RT-PCR的验证结果显示A组创面组织中大鼠-微小RNA-29b、大鼠-微小RNA-347的表达量较B组分别为上调2.58倍、下调1.89倍;与芯片检测结果接近(分别为上调2.67倍、下调2.18倍)。⑥KEGG信号通路功能富集分析显示差异表达明显的微小RNA参与MAPK信号途径、Wnt信号途径、转化生长因子β信号途径、表皮生长因子受体信号途径等与创面修复相关的信号通路。结论:(1)糖尿病大鼠与正常大鼠皮肤创面组织中的微小RNA表达差异明显,功能富集分析显示其与创面修复相关的信号通路密切相关,可能与糖尿病创面难愈合机制存在密切的联系。(2)rhGM-CSF凝胶可促进糖尿病大鼠创面愈合,引起创面组织中微小RNA差异性表达,这可能是其促进创面愈合在基因转录后水平上的靶点。
【关键词】：粒细胞巨噬细胞集落刺激因子 重组 糖尿病 实验性 伤口愈合 基因表达谱 微小RNA
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R587.1;R641
【目录】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-11
• 第一部分 糖尿病创面与正常创面微小RNA差异表达谱分析11-26
• 1 前言11
• 2 材料和方法11-17
• 2.1 材料11-12
• 2.1.1 实验动物11-12
• 2.1.2 主要试剂12
• 2.1.3 主要仪器12
• 2.2 方法12-17
• 2.2.1 糖尿病大鼠模型的建立12-13
• 2.2.2 糖尿病大鼠与正常大鼠创面模型的建立13
• 2.2.3 样本采集13
• 2.2.4 提取组织中的总RNA13-14
• 2.2.5 总RNA质量检查14
• 2.2.6 总RNA的分离纯化14
• 2.2.7 微小RNA的荧光标记和芯片杂交14-15
• 2.2.8 杂交芯片的清洗、扫描和芯片数据提取15
• 2.2.9 芯片数据处理15
• 2.2.10 实时荧光定量RT-PCR验证芯片结果15-17
• 2.2.11 差异表达微小RNA功能富集分析17
• 3 结果17-24
• 3.1 糖尿病大鼠成模情况17
• 3.2 总RNA质检结果17-18
• 3.3 微小RNA芯片检测结果18-20
• 3.4 实时定量RT-PCR检测结果20-21
• 3.5 差异表达微小RNA功能富集分析结果21-24
• 4 讨论24-26
• 第二部分 重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子对糖尿病大鼠创面愈合及微小RNA表达的影响26-37
• 1 前言26
• 2 材料与方法26-30
• 2.1 材料26-28
• 2.1.1 实验动物26-27
• 2.1.2 主要试剂27
• 2.1.3 主要仪器27-28
• 2.2 方法28-30
• 2.2.1 糖尿病大鼠模型的建立28
• 2.2.2 糖尿病大鼠创面模型的建立28
• 2.2.3 观测指标及评价方法28-29
• 2.2.4 微小RNA差异表达检测及验证29-30
• 2.2.5 统计学处理30
• 3 结果30-35
• 3.1 糖尿病大鼠成模情况30
• 3.2 创面愈合情况30-31
• 3.3 组织病理学观察31
• 3.4 创面CD31和PCNA抗体表达31-32
• 3.5 微小RNA差异表达检测结果及验证32-35
• 3.5.1 总RNA抽提及质检32
• 3.5.2 微小RNA芯片检测结果32-34
• 3.5.3 实时荧光定量RT-PCR检测34
• 3.5.4 KEGG信号通路功能富集分析34-35
• 4 讨论35-37
• 全文结论37-38
• 致谢38-39
• 参考文献39-42
• 附图42-50
• 攻读学位期间的研究成果50-51
• 综述51-63
• 参考文献58-63

【参考文献】

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