磷酸化HSP27保护烧伤血清刺激条件下血管内皮屏障的作用与机制研究

发布时间：2017-07-27 09:24

  本文关键词：磷酸化HSP27保护烧伤血清刺激条件下血管内皮屏障的作用与机制研究

  更多相关文章： 烧伤 F-actin HSP27 SUMO化修饰 磷酸酶2A 内皮通透性

【摘要】：血管通透性增高是烧伤早期休克和脏器水肿的根本原因,其本质是血管内皮屏障通透性的增高,从而导致早期血管内液大量外渗,引发全身组织灌注减少和组织器官水肿。由于烧伤早期血管通透性增高机制尚未得到充分证实,目前临床上缺少有效的防治措施。因此,深入揭示烧伤后微血管通透性变化的分子调节机制,研究防治微血管渗漏和烧伤休克的新型策略,具有重要的理论价值和临床意义。内皮细胞回缩是多种病理生理(包括烧伤)条件下内皮细胞间裂隙形成、微血管通透性增高的重要基础。以往认为,应力纤维中F-actin与肌球蛋白相互作用,产生向心收缩力,是内皮细胞回缩的骨架基础,而HSP27磷酸化则是应力纤维形成的重要分子机制。然而,最近有研究发现,磷酸化HSP27通过促进应力纤维形成或保护F-actin骨架,显著降低了缺氧或急性炎症等条件下血管内皮通透性。p38激酶/MK2是HSP27磷酸化的关键信号途径。我们以往发现,烧伤后血管内皮通透性增高并不与应力纤维形成相平行。烧伤后内皮细胞F-actin骨架发生了复杂变化,即:早期形成应力纤维,后期F-actin破坏、解聚或排列紊乱。我们前期预实验结果显示,烧伤血清刺激条件下内皮细胞HSP27磷酸化水平仅短暂升高。鉴于磷酸化HSP27降低血管通透性作用的相关认识,我们推测,p38激酶-HSP27磷酸化很可能是烧伤后血管内皮屏障的重要保护性适应机制,只是随着时间延长,促通透性因素的级联放大,p38激酶-HSP27磷酸化这一保护性适应机制不断削弱,使得血管通透性增高。本项目提出HSP27磷酸化是烧伤后血管内皮屏障的重要保护性适应机制的假设。拟以烧伤患者血清为刺激因素,以大鼠微血管内皮细胞为对象,采用基因突变技术构建磷酸化和非磷酸化HSP27表达突变体,探讨HSP27的磷酸化状态与烧伤血清刺激条件下肺血管内皮细胞应力纤维形成和通透性变化的关系;从蛋白磷酸酶PP2A调节HSP27去磷酸化和SUMO化修饰对MK2活性的抑制作用两方面,初步明确HSP27磷酸化随时间削弱的分子机制。研究对深入揭示烧伤后微血管通透性变化的分子调节机制,从细胞内源性保护角度促成防治微血管渗漏和烧伤休克的新型策略,具有重要意义。一、研究目的探讨磷酸化hsp27在烧伤血清刺激诱导血管内皮通透性变化中的作用及其调节机制。二、研究内容1.hsp27磷酸化、蛋白表达和分布与内皮细胞应力纤维形成、通透性变化关系的研究2.hsp27磷酸化在烧伤血清刺激诱导血管内皮通透性变化中的作用3.pp2a与mk2的sumo化修饰对hsp27磷酸化的调节作用研究三、研究方法1.按常规方法收集严重烧伤患者血清(浅二度、深二度和三度烧伤面积50%的患者)2.培养大鼠肺微血管内皮细胞,利用transwell小室建立单层内皮细胞通透性实验模型,采用跨单层内皮细胞电阻法(teer)评估内皮单层通透性变化。3.采用细胞免疫荧光化学染色技术观察内皮细胞zo-1、f-actin形态分布变化;采用imagej软件计算内皮细胞间隙和细胞表面积变化。4.采用westernblot技术检测烧伤血清刺激条件下内皮细胞p38激酶、mk2和hsp27磷酸化水平以及mk2的sumo化修饰。5.构建磷酸化、非磷酸化和野生型hsp27腺病毒高表达载体,并成功转染内皮细胞。6.采用oa抑制pp2a和转染senp1腺病毒抑制mk2的sumo化修饰,探讨pp2a去磷酸化作用和sumo化修饰抑制mk2活性对hsp27磷酸化的调节作用。四、主要结果1.烧伤血清刺激1h,肺微血管内皮细胞通透性显著增强,随着刺激时间延长,通透性进一步增强;同时,细胞间紧密连接完整性破坏,伴细胞间裂隙增加和细胞表面积缩小。2.烧伤血清刺激0.5h,内皮细胞中央型f-actin应力纤维形成增多;随着刺激时间延长,中央型f-actin应力纤维消失,代之以不规则的细胞周边型f-actin形成增多。3.烧伤血清使p38mapk-mk2-hsp27信号通路激活;其中,p38mapk/mk2呈持续活化,而hsp27磷酸化仅在烧伤血清刺激0.5h时大幅增强,随后迅速回落。hsp27磷酸化瞬时增强与内皮细胞应力纤维形成时间相吻合,二者高峰均出现于内皮细胞通透性增高之前。4.构建的磷酸化、非磷酸化和野生型HSP27腺病毒高表达载体能有效转染内皮细胞并高表达目的蛋白。较之非磷酸化HSP27和空载体转染对照组,磷酸化HSP27转染能显著抑制烧伤血清导致的内皮细胞高通透性,使细胞中央型F-actin应力纤维形成增多。此外,磷酸化HSP27可以部分对抗细胞松弛素D导致的内皮通透性增高。5.内皮细胞PP2A可与HSP27发生相互作用,且这一作用在烧伤血清刺激条件下进一步增强,抑制PP2A可使烧伤血清刺激条件下内皮细胞HSP27磷酸化部分增强。内皮细胞中MK2存在SUMO化修饰,且该修饰作用在烧伤血清刺激条件下进一步增强。高表达SENP1可显著解除SUMO蛋白对MK2活性的抑制作用,使HSP27的磷酸化水平升高。6.HSP27磷酸化是维护烧伤血清刺激条件下内皮细胞屏障功能的适应性保护反应,其通过促进中央型F-actin应力纤维形成对抗血管内皮高通透性。PP2A对HSP27的去磷酸化作用和SUMO化修饰对MK2活性的抑制作用是烧伤血清刺激条件下HSP27磷酸化迅速削弱的重要分子机制。
【关键词】：烧伤 F-actin HSP27 SUMO化修饰 磷酸酶2A 内皮通透性
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R644
【目录】：

• 缩略语表4-6
• 英文摘要6-9
• 中文摘要9-12
• 第一章 前言12-15
• 第二章 HSP27 磷酸化、蛋白表达和分布与内皮细胞应力纤维形成、通透性变化关系的研究15-29
• 2.1 材料与方法15-23
• 2.2 结果23-26
• 2.3 讨论26-27
• 2.4 小结27-29
• 第三章 磷酸化HSP27在烧伤血清诱导血管内皮高通透性中的作用与机制29-39
• 3.1 材料与方法29-32
• 3.2 结果32-37
• 3.3 讨论37-38
• 3.4 小结38-39
• 第四章 烧伤后内皮细胞HSP27磷酸化随时间削弱的分子调节机制39-48
• 4.1 材料与方法39-42
• 4.2 结果42-46
• 4.3 讨论46-47
• 4.4 小结47-48
• 全文结论48-49
• 参考文献49-52
• 文献综述 血管内皮通透性的体外检测方法52-58
• 参考文献56-58
• 攻读学位期间的研究成果58-59
• 致谢59

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本文编号：580751