人脐带沃顿胶间充质干细胞移植治疗对大鼠脑损伤区微循环的影响

发布时间：2017-08-30 17:10

  本文关键词：人脐带沃顿胶间充质干细胞移植治疗对大鼠脑损伤区微循环的影响

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【摘要】：背景 创伤性颅脑损伤（traumatic brain injury, TBI）是神经外科最常见的疾病之一，随着社会经济的飞快发展，跌落伤、交通伤、以及暴力伤等引起的TBI患者也同比增加。TBI的幸存者大部分都留下了不同程度的神经心理疾病及肢体运动感觉障碍等，影响了他们的工作、生活以及社会活动，他们一般都要进行长时间的康复治疗，并且需要陪护，这就浪费了大量的社会资源。微循环的主要功能是进行物质交换，以及通过微动脉阻力的变化控制组织器官血流量的大小，可是微循环的血管的舒缩活动的控制主要与局部的代谢活动有关，，因此局部代谢的变化会造成微循环的障碍，进一步导致器官的生理功能受到影响。创伤性颅脑损伤出现的脑微循环的障碍是该病极为重要的病理生理学变化，是继发性损害的关键环节，也是疾病转归和影响神经功能恢复的关键因素。防治创伤性颅脑外伤后的脑微循环障碍是神经外科重点关注的领域之一。 有研究证实骨髓间充质干细胞移植治疗骨缺损时分泌血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)可以促进新生血管生成，但是对于创伤性颅脑损伤损伤区微循环的影响尚未可知，并且骨髓间充质干细胞由于取材不便、细胞数量受年龄限制等原因限制了应用前景。人脐带沃顿胶间充质干细胞（mesenchymal stromal cells derived from Wharton’s jelly cells, WJCs）具有来源广泛，且较其它间充质干细胞易于分离培养、能够大量获取、且增殖分化能力较强等优点。人脐带沃顿胶间充质干细胞可以通过促进各种营养因子的分泌对受损的神经系统起到保护及治疗作用。目前尚没有关于人脐带沃顿胶间充质干细胞移植后对脑损伤区域的脑微循环变化的研究，本研究将致力于人脐带沃顿胶间充质干细胞移植对脑损伤区微循环的影响。 近年来，功能磁共振成像技术取得了飞速的发展，除了能显示的形态结构学信息，还可以反映脑损伤后代谢、生理等方面的功能改变的信息。磁共振灌注成像（perfusion-weighted imaging, PWI)，常采用单次激发的平面回波自由感应衰减(echo planar imaging of free induction decay, EPI-FID)序列，注入的造影剂到达脑组织感兴趣区，使局部磁场改变而获得信号。PWI能够检出局部组织的血流灌注情况，并且可以分析血流动力学的改变以及功能的变化，并能根据需要重点反映组织的微血管分布以及血流灌注的情况。 目的 观察人脐带沃顿胶间充质干细胞移植对SD大鼠脑损伤区域的微循环变化的影响，探讨微循环变化对损伤区脑组织的保护及修复作用。 材料与方法 1.实验动物：SPF级雄性SD大鼠72只(8周龄，体重250~300g)由河南省实验动物中心提供。跟据国家发布的《关于善待实验动物的指导性意见》，对实验动物进行适宜的安置。让大鼠自由的摄食与饮水,室温始终控制在(23±2)℃，相对湿度控制在40%-60%。 2.细胞的分离与培养：离体的脐带由健康足月剖宫产产妇志愿捐献，由郑州大学第一附属医院妇产科提供，无菌环境下取脐带一段，剥离脐带外膜，将沃顿胶组织剪碎后放置于含有bFGF（20μg/L）和FBS（10%）的DMEM/F12培养基中，在含有CO2（5%）的37摄氏度的培养箱中进行培养及传代。取传代至P3代的人脐带沃顿胶间充质干细胞进行镜下观察及流式细胞仪检测。 3.TBI模型的制作及分组:模型的建立采用Feeney的自由落体撞击法，根据相关文献建立大鼠中度创伤性颅脑损伤模型。72只SD大鼠被随机分为4组：依次为假手术组（A组），切开头部皮肤，颅骨钻孔后不损伤脑组织不移植细胞；移植对照组（B组），制作中度创伤性颅脑损伤模型成功后经股静脉静脉注射0.3ml生理盐水；WJCs移植组（C组），制作中度创伤性颅脑损伤模型成功后经股静脉静脉注射WJCs混悬液0.3ml；正常组（D组），无任何损伤及干预措施。 4. PWI序列扫描：采用美国GE公司Discovery MR7503.0T高场强磁共振仪和大鼠专用线圈，各组大鼠均进行横轴位T1加权成像（T1-weighted imaging,T1WI）和T2加权成像（T2-weighted imaging, T2WI）、矢状位T2WI、冠状位T2WI及PWI的扫描。根据横轴位T2WI扫描图像为参考，观察大鼠脑外伤后损伤灶周围皮质、丘脑、海马及对侧相应部位在磁共振图像上随时间的变化情况，并记录相应时间点相应部位脑组织的参数包括CBF和CBV。计算上述指标的相对值(伤侧/健侧)，分别得到rCBF和rCBV，尽可能降低个体差异所引起的误差。比较实验组与对照组大鼠感兴趣区rCBF和rCBV值是否有显著差异。 5.组织学观察：采用mNSS行为学评分法评价大鼠神经功能；组织学切片观察大鼠颅脑损伤的移植细胞生存状况，及损伤区微循环的变化；电镜观察损伤区周围的神经细胞的存活状态。 6.统计学分析：采用SPSS17.0统计软件进行统计学分析，计量资料采用X SD表示。正常对照组与实验组计量资料比较采用两随机样本t检验。以P0.05表示差异具有统计学意义。 结果 1.行为学评分：大鼠在建立创伤性颅脑损伤模型后，其神经运动及感觉功能的恢复在7d是呈现出一定的差异性，根据mNSS行为学评分结果，A组和D组因为未受打击，所以其神经运动感觉功能正常为0分，B组（10.22±0.94），C组（9.02±1.06），差异有统计学意义(P0.05)。 2.功能磁共振检测：TBI大鼠的颅脑损伤区的PWI序列扫描结果经整理得出rCBF和rCBV，rCBF和rCBV经统计分析显示大鼠的脑损伤区在7d时B组和C组的差异明显，A组（99.24±0.87;101.36±0.98），B组（123.68±18.89;102.55±17.46）， C组（131.03±17.37;115.21±14.66）和D组（99.56±0.51;99.68±0.84），差异有统计学意义(P0.05)。 3.组织学观察：TBI大鼠的颅脑损伤区的微血管面密度在3d，7d和2w时，B组与C组比较差异明显，B组3d、7d和2w是结果分别为（9.56±3.78），（20.62±3.25），（21.93±2.12），C组3d、7d和2w是结果分别为（12.38±2.45），（31.79±3.28），（33.59±3.52），有统计学意义（P＜0.05）。TBI大鼠的颅脑损伤区的血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor VEGF)的阳性染色显示，B组在3d、7d和2w均低于C组。TBI大鼠的颅脑损伤区在2w和4w行免疫组化观察胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein GFAP)的阳性表达率显示，B组无阳性染色，C组有阳性染色。TBI大鼠的颅脑损伤区在2w和4w行免疫组化观察神经元特异性烯醇化酶(neuron specific enolase NSE)蛋白阳性表达率显示，B组无阳性染色，C组有阳性染色。 结论 WJCs经股静脉移植可以显著促进VEGF在脑损伤区的表达，促进脑损伤区周围脑组织的毛细血管的生成。通过改善损伤局部的脑微循环，对创伤性颅脑损伤有明显的治疗作用。显著改善了TBI大鼠的运动及感觉功能。
【关键词】：创伤性颅脑损伤 人脐带沃顿胶间充质干细胞 细胞移植 大鼠 微血管面密度 PWI
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R651.15
【目录】：

• 摘要4-8
• Abstract8-14
• 中英文缩略词表14-15
• 前言15-18
• 材料与方法18-25
• 结果25-30
• 讨论30-37
• 结论37-38
• 附图38-42
• 参考文献42-47
• 综述47-61
• 参考文献56-61
• 个人简历及攻读硕士学位期间发表论文61-62
• 致谢62

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前9条

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本文编号：760542