人骨髓间充质干细胞转分化为汗腺样细胞的DNA甲基化调控机制

发布时间：2017-09-03 10:11

  本文关键词：人骨髓间充质干细胞转分化为汗腺样细胞的DNA甲基化调控机制

  更多相关文章： 汗腺细胞 骨髓间充质干细胞 DNA 甲基化 表观遗传学

【摘要】：目的:(1)优化人外分泌汗腺细胞(sweat gland cells,SGCs)的分离方法,以高效地获取原代汗腺细胞。(2)建立体外诱导人骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)向汗腺样细胞分化的共培养体系,并观察诱导后细胞形态、表型和相关基因表达的改变。(3)探讨DNA甲基化在BM-MSCs向汗腺样细胞转分化过程中的调控作用,并寻找甲基化调控的靶点基因。方法:(1)取新鲜的全皮层组织,剪成小块微粒,分别用不同的方法(胰酶+胶原酶,单纯胰酶,单纯胶原酶)消化分离汗腺,观察消化过程中出现游离汗腺的时间;微量移液器挑取游离汗腺,进行体外培养,观察细胞的贴壁情况和生长状态;9天后,流式细胞仪检测存活下来的细胞的增殖能力,并利用免疫细胞化学检测汗腺细胞的表面抗原CK7和CEA的表达状况。(2)购买骨髓间充质干细胞系,体外培养、扩增,并进行细胞的成脂肪、成骨细胞分化能力的鉴定;选取第三代的BM-MSCs与热休克后汗腺细胞(47℃)进行Transwell+诱导因子的共培养,分别于第3、6、9天观察细胞形态学的变化,设置汗腺细胞为阳性对照组。细胞免疫荧光技术检测细胞汗腺表面抗原CK7和CEA的表达,RT-PCR和Western blot分别检测CK7、CEA在mRNA水平和蛋白水平的表达变化。(3)采用Illumina 450K甲基化芯片检测转分化前后细胞的甲基化水平的变化,筛选甲基化差异性基因,随后对差异基因进行生物信息学分析(差异位点筛选、聚类层次分析、Gene Ontology、KEGG Pathway分析、生物学功能注释、蛋白-蛋白相互作用);结合预实验结果和相关文献,对若干候选基因(HDAC4、PAX6、MMP1、EDA等),用甲基化特异性PCR(Methylation Specific PCR,MSP)进行初步验证,然后通过Mass Array飞行质谱技术对特定基因位点进行重点分析;最后,构建特定基因的重组质粒,体外转染BM-MSCs,观察质粒转染后细胞表型和相关基因的表达情况。结果:(1)酶联合消化法(a组)在2h时,镜下可见较多游离的汗腺细胞;胰蛋白酶-edta法(c组)获取的细胞贴壁很差;胶原酶法(b组)在6h左右时,才有较多的游离汗腺出现。a组和b组获取后的汗腺细胞贴壁良好,生长增殖正常,流式检测结果显示:a组和b组细胞的增殖指数分别为(18±4)%和(17±6)%,无统计学差异。免疫细胞化学表型鉴定结果显示:酶联合消化组和胶原酶组获取的细胞cea、ck7阳性率未见明显差异。(2)通过多向分化潜能实验,我们证实bm-mscs可以分化为脂肪细胞和骨细胞。transwell+诱导因子共培养3天时,bm-mscs的细胞形态基本没有变化,仍呈长梭形;共培养9d后,细胞形态呈多样化,部分细胞出现近似于汗腺样细胞的改变,由诱导前的长梭形变为扁平不规则状,并且逐步聚集呈向心性生长。对汗腺样细胞进行细胞免疫荧光、rt-pcr和westernblot检测,都发现其不同程度地表达汗腺细胞表面抗原ck7、cea。(3)采用illumina甲基化芯片,在全基因组范围内初步筛选出甲基化水平明显差异的探针位点693个;甲基化差异性基因有437个基因(升高97个,下降350个);差异位点区域分布显示:主要分布在n_shore和cpgislands区域,基因区域分布主要集中在genebody和tss200区域。geneontology和keggpathway分析显示:主要涉及细胞命运界定、信号转导与基因表达、转录阻遏、外胚层发育等生物学过程。msp和massarray飞行质谱结果显示:与诱导前bm-msc相比,诱导后汗腺样细胞中hdac4的甲基化水平明显下调,与甲基化芯片结果大体一致。转染hdac4质粒载体后,免疫细胞化学和rt-pcr结果都显示cea表达明显上调。结论:(1)胰蛋白酶和胶原酶联合应用能明显缩短汗腺细胞的分离时间,且不影响细胞的增殖活性和抗原表达情况。(2)bm-mscs和热休克汗腺间接共培养体系(transwell+诱导因子)提供了适宜转分化的微环境,并且通过该方法成功的获得了汗腺样细胞。(3)作为表观遗传修饰的重要方式—dna甲基化,参与并影响着bm-mscs向汗腺样细胞转分化的过程。(4)HDAC4可能是对CEA选择性的入核转录进行调控,表现在转染HDAC4质粒后,CEA表达上调,进而影响着转分化为汗腺样细胞的生物学过程。
【关键词】：汗腺细胞 骨髓间充质干细胞 DNA 甲基化 表观遗传学
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R644
【目录】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-12
• 缩略语/符号说明12-14
• 前言14-17
• 研究现状、成果14-16
• 研究目的、方法16-17
• 一、优化人外分泌汗腺细胞的分离方法17-26
• 1.1 对象和方法17-22
• 1.1.1 主要试剂17-18
• 1.1.2 主要仪器18-19
• 1.1.3 主要试剂配制19-20
• 1.1.4 标本取材及处理20
• 1.1.5 检测指标与方法20-22
• 1.1.6 统计学分析22
• 1.2 结果22-24
• 1.2.1 不同消化方法分离汗腺的结果22
• 1.2.2 汗腺细胞的生长状态和生长活性观察22-23
• 1.2.3 汗腺细胞的增殖指数测定结果23
• 1.2.4 汗腺细胞表型的鉴定结果23-24
• 1.3 讨论24-25
• 1.4 小结25-26
• 二、建立hBM-MSC与汗腺细胞共培养诱导体系26-45
• 2.1 对象和方法26-38
• 2.1.1 主要试剂26-29
• 2.1.2 主要仪器29
• 2.1.3 主要试剂配制29-32
• 2.1.4 BM-MSC复苏、培养32
• 2.1.5 BM-MSC形态、表型、多向分化能力的鉴定32-34
• 2.1.6 BM-MSC与汗腺细胞共培养实验34
• 2.1.7 汗腺样细胞的检测指标与鉴定34-38
• 2.1.8 统计学分析38
• 2.2 结果38-43
• 2.2.1 BM-MSCs形态、表型、多向分化能力的鉴定38-40
• 2.2.2 诱导前后细胞形态、表型及相关基因变化40-43
• 2.3 讨论43-44
• 2.4 小结44-45
• 三、BM-MSC转分化为汗腺样细胞过程中DNA甲基化的研究45-64
• 3.1 对象和方法45-50
• 3.1.1 主要仪器与软件45
• 3.1.2 主要材料与试剂45-46
• 3.1.3 Illumina 450K甲基化芯片46-47
• 3.1.4 DNA甲基化相关的生物信息学分析47-49
• 3.1.5 甲基化芯片数据的验证49-50
• 3.1.6 HDAC4质粒载体的构建及转染BM-MSCs50
• 3.2 结果50-61
• 3.2.1 DNA甲基化相关的生物信息学分析50-58
• 3.2.2 MSP和Mass Array对芯片结果的验证58-60
• 3.2.3 HDAC4表达质粒转染后相关基因的变化60-61
• 3.3 讨论61-62
• 3.4 小结62-64
• 结论64-65
• 参考文献65-69
• 发表论文和参加科研情况说明69-71
• 综述 DNA甲基化对干细胞分化的影响及其作用方式71-80
• 综述参考文献75-80
• 致谢80

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 陈晓鹏;刘志强;周春燕;;基因组DNA甲基化修饰在胚胎干细胞分化过程中的作用[J];医学分子生物学杂志;2007年06期

2 ;The genomic landscapes of histone H3-Lys9 modifications of gene promoter regions and expression profiles in human bone marrow mesenchymal stem cells[J];遗传学报;2008年10期

，

本文编号：784367