人脂肪间充质干细胞的分离鉴定及向肝脏样细胞分化的实验研究

发布时间：2017-09-15 15:09

  本文关键词：人脂肪间充质干细胞的分离鉴定及向肝脏样细胞分化的实验研究

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【摘要】：目的探讨人脂肪间充质干细胞体外分离、培养、鉴定及向肝脏样细胞分化的方法。 方法将脂肪组织切成小于1mm3的碎片，用胶原酶Ⅰ消化离心法获得人脂肪间充质干细胞，然后以1×104/cm2的细胞浓度，接种于含体积分数为10%胎牛血清的低糖DMEM培养基中,置于培养箱中进行原代培养；观察原代细胞形态及生长情况；取第5代细胞接种于24孔板中，每天消化3个孔，计算细胞数量，取其平均数绘制细胞生长曲线；取第5代细胞，胰酶消化后，用流式细胞仪检测干细胞相关表面抗原CD13、CD73、CD34、CD45和HLA-DR；取第5代细胞接种于6孔板中，实验组分别用诱导培养基向成脂及成骨方向诱导，对照组用含10%胎牛血清的低糖DMEM培养基培养，检测其多向分化潜能；取第5代细胞，接种于培养瓶及24孔板中，实验组用含有ActivinA、HGF、FGF、EGF、OSM、DMSO等细胞因子的两阶段法肝脏样细胞诱导培养基培养，对照组用含10%胎牛血清的低糖DMEM培养基培养，并观察细胞形态变化及生长情况，于诱导至第13天时，采用RT-PCR法检测肝细胞相关基因表达，，采用PAS染色法检测肝脏样细胞糖原合成情况，采用细胞免疫组化法检测肝细胞相关抗原的表达。 结果用消化离心法分离获取的脂肪间充质干细胞大小均匀，呈梭形的成纤维细胞样，细胞增殖良好；细胞生长曲线测定表明接种后第3天细胞进入指数增长期，第6天后生长进入平台期，体外能长期培养存活，并保持不分化状态；流式细胞仪检测表明细胞高表达CD13、CD73，低表达CD34、CD45及HLA-DR；并能被诱导成脂肪细胞及成骨细胞；上述结果表明成功构建了人原代脂肪干细胞系。人脂肪干细胞经成肝诱导后，细胞形态由梭形逐渐变为多角形或类圆形。诱导至第13天时，RT-PCR检测结果提示，实验组细胞高表达ALB、AFP、CY3P4肝细胞相关基因，而对照组细胞呈低表达及无表达状态；实验组细胞PAS染色呈红色阳性表现；细胞免疫组化证实，实验组细胞高表达肝细胞特异性抗体HepPar-1、AFP、CK18、CK19，与肝癌细胞表达相同，而对照组细胞则表现为阴性。 结论利用消化离心法在体外能分离得到脂肪间充质干细胞，在体外可长期存活，反复传代，诱导后可分化为肝脏样细胞，为脂肪间充质干细胞做为细胞治疗、生物人工肝及肝组织工程的种子细胞提供理论依据。
【关键词】：人脂肪间充质干细胞 分离 鉴定 诱导 肝脏样细胞
【学位授予单位】：中国人民解放军医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R575.3
【目录】：

• 英文缩略词表5-6
• 中文摘要6-8
• Abstract8-10
• 前言10-12
• 引言12
• 材料与方法12-21
• 结果21-28
• 讨论28-32
• 总结32-33
• 参考文献33-37
• 文献综述37-45
• 参考文献40-45
• 攻读学位期间发表文章45-46
• 致谢46-47

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本文编号：857259