BBG对大鼠脑创伤后炎性反应的抑制作用及机制研究

发布时间：2017-09-18 03:23

  本文关键词：BBG对大鼠脑创伤后炎性反应的抑制作用及机制研究

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【摘要】：目的探讨细胞膜门控离子通道P2X7与脑创伤后炎性反应的关系；应用P2X7受体抑制剂BBG进行干预，检测其对炎性因子IL-1β、TNF-α及PKCγ表达的影响，探讨BBG的抗炎作用和脑保护机制，为脑创伤后的炎性反应作为治疗靶点的研究开辟新的思路。 方法应用120只SD雄性大鼠随机分为3组：①Sham组（n=40），②TBI组（n=40）③BBG组（n=40）。各组分为创伤后6h、12h、24h及48h四个时间点观察取材。使用Marmarou法建立中度弥漫性TBI模型。对下列指标进行检测：①使用HE染色法观察，脑组织海马CA1区的形态学变化；②使用干湿比重法检测各组的脑组织水肿程度；③激光共聚焦法检测PKCγ的表达定位情况；④Western-blot法检测PKCγ、IL-1β、TNF-α和P2X7的蛋白表达量。⑤另取32只大鼠在创伤后7-11天行Morris水迷宫测试，对其空间学习和记忆能力进行检测。应用Gel-Doc软件分析系统对部分实验结果进行量化。实验数据以均数±标准差表示，统计学分析采用SPSS16.0软件，使用重复的单因素方差分析，两两比较用q检验，以P＜0.05表示差异具有统计学意义。 结果1HE染色结果：Sham组海马区的神经元结构完整、数目较多、排列规则。TBI组织疏松，明显水肿，微血管周围间隙和细胞周围间隙显著增宽；海马区神经元结构破坏、排列不规律、数量显著减少，胞浆嗜色性明显减弱，核固缩，部分核仁消失。BBG组病理学改变仍然明显，但是与TBI组比较，水肿有所减轻，微血管及细胞周围间隙的增宽程度减小；海马区神经元结构相对较完整，胞核固缩较TBI组有所减轻。2大鼠的空间学习记忆功能检测结果：与Sham组比较，TBI组大鼠平均逃避潜伏期显著增长（P＜0.05）。与TBI组比较，BBG组在9、10天平均逃避潜伏期显著缩短（P＜0.05），，但仍然长于sham组。在创伤后11天的空间搜索实验过程中，与Sham组相比，TBI组穿越平台次数、平台所在象限路程比及时间比均显著减少（P＜0.05）；与TBI组相比，BBG治疗组穿越平台次数和2个比值均显著增加（P＜0.05）。3脑水肿的测定：Sham组在各个时间点的脑组织水含量未见差异。TBI组的脑组织水含量随创伤后时间延长逐渐升高，在3h、6h、12h、24h均显著高于sham组。BBG治疗组3-24h的含水量显著低于TBI组（P＜0.05），但仍略高于sham组。4P2X7的Western blot检测结果：sham组P2X7有很弱的基础表达且各时间点表达无明显差异。TBI组与sham组对比，6h时P2X7表达开始升高（P＜0.05），12h达到高峰（P＜0.05），24h开始回落，至48h逐渐减弱但仍高于sham组（P＜0.05）。BBG组P2X7表达强度和时间变化趋势与TBI组类似，但在创伤后6-48h的表达量仍然高于sham组（P＜0.05）。5PKCγ的Western blot检测结果：Sham组：平均光密度分析发现仅有少量PKCγ表达，其表达量在各时间点无差异。TBI组：PKCγ蛋白量与Sham组比较，伤后6h增高（P＜0.05），12h达到高峰（P＜0.05），持续高表达至创伤后24h（P＜0.05），创伤48h后PKCγ蛋白表达有所下降，但仍显著高于Sham组（P＜0.05）。BBG组：PKCγ蛋白表达与时间的对应关系和TBI组类似，但表达量显著低于TBI组，其在伤后6-48h的差异具有统计学意义（P＜0.05）。6IL-1β的Western blot检测结果: Sham组仅有少量IL-1β表达，其表达量在各时间点无差异。TBI组与Sham组比较，伤后6h增高（P＜0.05），12h达到高峰（P＜0.05），持续高表达至创伤后24h（P＜0.05），创伤48h后IL-1β蛋白表达有所下降，但仍显著高于Sham组（P＜0.05）。BBG组IL-1β蛋白表达随时间变化的趋势与TBI组类似，其表达量略低于TBI组，在伤后24h和48h的差异具有统计学意义（P＜0.05）。7PKCγ与NeuN的共聚焦检测结果：FITC标记的绿色荧光显示PKCγ的表达，TRITC标记的红色荧光显示神经元标记物NeuN的表达。在TBI后24h，NeuN（红色）与PKCγ（绿色）在海马区存在共定位。8TNF-α western blot检测结果：Sham组TNF-α蛋白表达量的比值在各时间点无变化。TBI组与Sham组比，在伤后6h开始升高（P＜0.05），12h达到高峰（P＜0.05），24-48h有所下降，但仍高于Sham组（P＜0.05）。BBG治疗组TNF-α显著低于TBI组，在伤后6-12h的差异具有统计学意义（P＜0.05）。 结论BBG对大鼠脑创伤后继发性脑损害具有保护作用，其机制之一是通过抑制P2X7的表达，进而抑制炎性因子IL-1β、TNF-α以及蛋白激酶PKCγ的表达，从而减轻脑水肿和脑组织损伤程度，保护神经元，改善神经功能状态和记忆学习能力。通过影响小胶质细胞的功能，为改善脑创伤后神经元功能状态提供了新的实验依据，有可能成为一个新的治疗靶点。
【关键词】：创伤性脑损伤 亮蓝 神经功能评分 P2X7 PKCγ IL-1β TNF-α 大鼠
【学位授予单位】：河北联合大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R651.15
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-11
• 引言11-13
• 第1章 实验研究13-44
• 1.1 材料与方法13-17
• 1.1.1 实验动物13
• 1.1.2 主要试剂13-14
• 1.1.3 主要设备及仪器14-15
• 1.1.4 实验所需溶液及其配制15-17
• 1.2 实验方法17-22
• 1.2.1 实验动物分组及给药方法17
• 1.2.2 大鼠 Marmarou’s 中度弥漫性脑创伤模型制备17-18
• 1.2.3 脑组织内含水量的测量18
• 1.2.4 空间学习记忆功能测试18
• 1.2.5 组织学标本的制备及相应染色方法18-22
• 1.2.6 Western blot 平均光密度（OD）测定及结果判定22
• 1.2.7 统计学处理22
• 1.3 结果22-33
• 1.3.1 弥漫性脑创伤模型的制备评价22-23
• 1.3.2 HE 染色结果23
• 1.3.3 大鼠的空间学习记忆功能检测结果23-26
• 1.3.4 脑组织水含量测定26-27
• 1.3.5 P2X7 的 Western blot 检测结果27-29
• 1.3.6 IL-1β与 TNF-α的 Western blot 检测结果29-31
• 1.3.7 PKCγ western blot 检测结果31-33
• 1.3.8 PKCγ与 NeuN 的激光共聚焦检测结果33
• 1.4 讨论33-38
• 1.4.1 大鼠 Marmarou 中度弥漫性脑创伤模型制作及效果评价33-34
• 1.4.2 小胶质细胞在炎性反应中的作用34-35
• 1.4.3 TBI 启动了 P2X7 介导的小胶质细胞的激活加重了创伤后的继发性损伤35-36
• 1.4.4 BBG 通过抑制 P2X7R 的激活发挥神经保护作用36-37
• 1.4.5 弥漫性脑创伤后给予 BBG 干预后下调 PKCγ改善了大鼠的神经功能障碍37-38
• 1.5 结论38
• 参考文献38-44
• 第2章 综述 小胶质细胞在中枢神经系统中作用44-56
• 2.1 小胶质细胞在炎性反应中的作用44-47
• 2.1.1 促炎性因子45
• 2.1.2 氧自由基（ROS）45-46
• 2.1.3 环氧化酶 2（COX-2）46
• 2.1.4 抗炎性细胞的介质46-47
• 2.2 小胶质细胞在神经变性型疾病中所起到的作用47-49
• 2.2.1 小胶质细胞与阿尔茨海默病47
• 2.2.2 小胶质细胞与帕金森病47-48
• 2.2.3 小胶质细胞与亨廷顿病48
• 2.2.4 小胶质细胞与多发性硬化病48
• 2.2.5 小胶质细胞与萎缩性肌肉侧索硬化症48-49
• 2.3 小胶质细胞与嘌呤受体49-51
• 2.3.1 P2Y 受体49
• 2.3.2 P2X 受体49-51
• 2.3.3 小胶质细胞与嘌呤受体51
• 2.4 小结与展望51-52
• 参考文献52-56
• 附录56-57
• 致谢57-58
• 导师简介58-59
• 作者简介59-60
• 学位论文数据集60

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