微小RNA miR-21转基因治疗促进皮肤创面愈合的实验研究

发布时间：2017-10-06 11:15

  本文关键词：微小RNA miR-21转基因治疗促进皮肤创面愈合的实验研究

  更多相关文章： miR-21 皮肤 创面修复 裸质粒

【摘要】：创伤愈合既是生物医学领域最古老的，同时也是现代医学不可回避的重要之一。从分子水平研究皮肤创伤发生、发展的过程，已使皮肤创伤研究提高到一个前所未有的水平。一系列生长因子、相关信号通路和功能蛋白的研究既从分子水平上深化了我们对于创伤机理的认识，又为促进创伤愈合提供了许多新的治疗手段和药物。近年来，一类参与基因表达转录后调控的重要分子——微小RNA（microRNAs，miRNAs）在多种生物学事件中的作用逐渐被揭示，其在皮肤创伤修复中的作用也越来越受到重视。我们和其他学者的研究表明，与肿瘤发生、发展密切相关的癌基因miR-21在小鼠皮肤创伤后表达上调显著，在创面局部抑制这种上调可以削弱修复、延缓愈合，提示miR-21是皮肤促愈的潜在靶点。然而，又有学者报道，miR-21在静脉曲张性难愈性溃疡也呈现高表达，以其模拟物干预大鼠急性创面认为其抑制愈合。创面过表达miR-21到底会对愈合产生何种影响？ miR-21是否为皮肤促愈的潜在靶点？为了明确这些问题，本课题分为以下三个部分进行研究： 1．pRc/CMV-miR-21真核表达载体构建及其生物活性鉴定。PCR扩增长度约为390bp含有pre-miR-21的小鼠基因组DNA序列，产物经Hind Ⅲ和XbaⅠ双酶切后纯化回收，连接到pRc/CMV空质粒上，转化感受态菌后涂板，挑取克隆经菌液PCR、酶切鉴定和测序分析获得pRc/CMV-miR-21阳性克隆。同时构建miR-21的荧光素酶报告质粒，将含有与miR-21分子完全互补的寡核苷酸序列插入到pMIR-Reporter质粒中荧光素酶基因的3′UTR，经酶切、测序证实获得pmiR-21-Luc reporter荧光素酶报告质粒。pRc/CMV-miR-21质粒转染293细胞经G418筛选后获得稳定表达的阳性克隆，经Northern blot检测具有成熟miR-21的阳性信号。共转染pmiR-21-Luc reporte与pRc/CMV-miR-21，可以有效降低pmiR-21-Luc reporte报告质粒的荧光素酶活性，表明pRc/CMV-miR-21的产物具有生物活性。 2．皮肤创缘注射pEGFP-N1报告基因裸质粒转基因干预创伤愈合小鼠模型的建立。以pEGFP-N1为报告基因质粒，在小鼠皮肤创缘周围分三点皮下注射pEGFP-N1裸质粒，然后观察EGPF蛋白在小鼠创面愈合中的表达定位及其强度变化的规律，以此间接确定mir-21真核质粒在干预后的皮肤创面修复中的表达特点。不同时相点创面组织的GFP免疫组化结果表明：GFP阳性细胞主要定位于新生肉芽组织，其阳性比例在伤后早期很低，随修复进行到第7d和10d最高，到修复末期（15d）又明显降低。表明裸质粒表达产物高峰期与创面修复关键期吻合，，而愈合后表达明显降低，具有自限性，能够有效干预创面修复。进一步以pRc/CMV-miR-21裸质粒注射到小鼠创面，通过原位杂交的方法半定量的分析miR-21的表达强度，证实了本方法可以有效提高修复期新生肉芽中miR-21的表达。为后续功能研究建立了一种简单、易行、有效的小鼠创面修复的转基因治疗模型。 3．miR-21转基因治疗促进小鼠皮肤创伤愈合的实验研究。以正常小鼠和自制Ⅱ型糖尿病小鼠的皮肤创面为模型，创缘周围分三点注射pRcCMV-miR-21真核载体表达质粒（实验组）和pRc/CMV空白质粒（对照组）。注射后不同时相点大体观察皮肤创面愈合情况，同时测定残留面积和创面愈合时间。各个时相点取材进行病理学观察，HE染色观察创面病理变化，Ki67免疫组化观察肉芽组织间细胞的增殖活性，Masson染色观察致伤30d后皮肤瘢痕的修复情况。结果表示，在正常创面和难愈性创面的大体观察中，实验组均比对照组愈合速度快，约提前2.5d。致伤后7d的HE病理切片也显示，治疗组较对照组肉芽组织向中心区域迁移更快，新生肉芽面积更大，但Ki67免疫组化显示两组肉芽间质中阳性细胞比例相当。同时发现，伤后7d治疗组较对照组再上皮化明显较快。在致伤30d后的Masson染色结果中，我们发现两组的胶原沉积均没有异常增多，表明miR-21转基因治疗没有影响到重塑后期胶原沉积。
【关键词】：miR-21 皮肤 创面修复 裸质粒
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R641
【目录】：

• 缩略语表5-6
• Abstract6-8
• 摘要8-10
• 第一章 前言10-12
• 第二章 PRC/CMV-MIR-21 真核表达载体构建及其生物活性鉴定12-32
• 2.1 材料和方法12-16
• 2.2 实验方法16-26
• 2.3 结果26-29
• 2.4 讨论29-31
• 2.5 小结31-32
• 第三章 皮肤创缘注射PEGFP-N1 裸质粒转基因干预创伤愈合小鼠模型的建立32-45
• 3.1 材料和方法32-33
• 3.2 实验方法33-39
• 3.3 结果39-43
• 3.4 讨论43-44
• 3.5 小结44-45
• 第四章 PRC/CMV-MIR-21 裸质粒创缘注射转基因治疗促进小鼠皮肤创伤愈合的实验研究45-64
• 4.1 材料和方法45-47
• 4.2 实验方法47-50
• 4.3 结果50-60
• 4.4 讨论60-63
• 4.5 小结63-64
• 全文总结64-65
• 1. 成功构建 pRc/CMV-miR-21 真核表达载体并验证其生物活性64
• 2. 在皮肤创缘注射 pEGFP-N1 裸质粒成功建立转基因干预创面修复的小鼠模型64
• 3. miR-21 转基因治疗能促进小鼠皮肤创伤愈合64-65
• 参考文献65-71
• 文献综述71-80
• 参考文献77-80
• 攻读硕士期间发表的论文80-81
• 致谢81

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本文编号：982470