lncRNA对炎症条件下人牙周膜干细胞成骨分化调控作用的研究

发布时间：2017-10-21 10:33

  本文关键词：lncRNA对炎症条件下人牙周膜干细胞成骨分化调控作用的研究

  更多相关文章： 牙周膜干细胞 炎症微环境中 长链非编码RNA microRNA 经典Wnt通路

【摘要】：牙周膜间充质干细胞(human periodontal mesenchymal stem cells,hPDLSCs)是一种牙周组织来源的间充质干细胞,既具有间充质干细胞的共性,多向分化能力,可以分化成骨组织,脂肪组织,软骨组织和神经组织,又具有其特殊性,即来源于牙周韧带组织。所以hPDLSCs自2004年被Seo等学者首次成功地分离培养之后,就被认为是最有潜力的修复牙周缺损的种子细胞。可是,微环境的改变会造成细胞功能的改变,近年来,多篇文献相继证实,炎症微环境会造成hPDLSCs成骨分化能力的下降。于是探索影响炎症微环境来源的hPDLSCs(periodontal mesenchymal stem cells from periodontitis patients,PDLSCs,pPDLSCs)成骨分化的因素,提高pPDLSCs的骨形成能力,就成了当前研究的重点和难点。已有许多文献从不同的角度分析了炎症微环境影响pPDLSCs成骨分化的机制,研究发现,经典的Wnt/β-catenin信号通路以及micro RNA(mi RNA)都在这一过程中发挥重要的调控作用。近年来,研究发现,长链非编码RNA(Long none noding RNAs,lncRNAs),这类转录本长度超过200bp且不编码任何蛋白质的RNA,在调控间充质干细胞分化的过程中发挥了重要的作用。有报道证实,lncRNAs可能参与了骨形成。lncRNAs发挥其调控作用的方式多种多样,但其中非常重要的一种是通过与m RNAs竞争mi RNAs来促进m RNAs的表达。在这一过程中,lncRNAs和mi RNAs可以形成复杂的调控网络调节靶基因,最终调控细胞功能。为了深入研究lncRNAs-mi RNAs网络在调控hPDLSCs成骨分化中的作用。本研究拟通过健康以及炎症来源的hPDLSCs中差异表达lncRNA的筛选,以及其中成骨相关lncRNA的确定;lncRNA-POIR在hPDLSCs和pPDLSCs成骨分化中调控作用的研究;lncRNA-POIR通过与Fox O1竞争mi R-182来调节pPDLSCs的成骨分化功能;Fox O1调节pPDLSCs的成骨分化的机制研究四个部分的实验进行探索,为恢复pPDLSCs的成骨分化能力,提高牙周缺损修复的治疗水平提供一定的参考。第一部分健康及炎症来源的hPDLSCs差异表达lncRNA筛选及成骨相关lncRNA的确定研究目的(1)hPDLSCs与pPDLSCs的分离培养与间充质干细胞特性的鉴定;(2)hPDLSCs、pPDLSCs差异表达lncRNA的筛选与分析;(3)pPDLSCs成骨相关lncRNA,lncRNA-POIR的确定。研究方法(1)应用单克隆培养法分离hPDLSCs和pPDLSCs;流式细胞术鉴定干细胞表面标记分子的表达;克隆形成试验鉴定细胞的克隆形成能力;茜素红染色和油红 O‖染色鉴定细胞的多向分化能力。(2)应用Arraystar Human Lnc RNA Microarray V3.0筛选hPDLSCs和pPDLSCs中差异表达的lncRNAs并利用q PCR技术进行验证;利用q PCR技术筛选出上述差异lncRNAs中pPDLSCs成骨分化前后改变最大的lncRNA(osteogenesis impairment-related lncRNA of periodontal mesenchymal stem cells from periodontitis patients,lncRNA-POIR)作为下一步研究的目标。(3)利用q PCR技术分析pPDLSCs成骨分化不同时间点lncRNA-POIR的表达情况,并明确lncRNA-POIR的表达与成骨相关基因Runx2,Col1之间是否存在相关性。实验结果(1)应用单克隆培养法分离培养的hPDLSCs和pPDLSCs阳性表达间充质干细胞表面标记物CD105、CD90、CD146、Strol-1,阴性表达造血系统来源细胞表面标记物CD34、CD45,具有克隆形成能力,成骨成脂分化功能。其中,pPDLSCs的克隆形成能力强于hPDLSCs,但成骨分化能力比hPDLSCs弱。(2)分析芯片结果发现,共有387个m RNA,和89个lncRNA差异表达(Change fold2,P0.05),我们选择了差异倍数在5倍以上的lncRNAs进行了q PCR验证,验证结果与芯片结果一致。在pPDLSCs成骨分化前后改变最大的lncRNA是ENST00000446358(lncRNA-POIR)。(3)lncRNA-POIR在成骨分化的1d,7d,14d表达水平不断升高,21d有所降低,但仍高于成骨分化前;其表达水平和Runx2、Col1的表达具有正相关性。结论(1)应用单克隆培养法可以成功分离培养具有间充质干细胞特性的hPDLSCs和pPDLSCs;相比于hPDLSCs,pPDLSCs增殖能力增强,成骨分化能力减弱。(2)成功筛选出hPDLSCs和pPDLSCs中差异表达的lncRNAs;lncRNA-POIR在pPDLSCs成骨分化中显著上调。(3)lncRNA-POIR可能参与调控pPDLSCs成骨分化。第二部分lncRNA-POIR在hPDLSCs和pPDLSCs成骨分化中调控作用的研究研究目的(1)明确lncRNA-POIR在体外环境中对hPDLSCs和pPDLSCs成骨分化的调节作用;(2)明确lncRNA-POIR在体内环境中对hPDLSCs和pPDLSCs成骨分化的调节作用。研究方法(1)构建lncRNA-POIR过表达慢病毒和lncRNA-POIR干扰质粒,并转染hPDLSCs和pPDLSCs;利用q PCR,茜素红染色,ALP染色和ALP活性测定实验检测lncRNA-POIR对hPDLSCs和pPDLSCs成骨分化的调控作用。(2)构建裸鼠体内细胞成骨模型,通过细胞转染技术上调或下调hPDLSCs和pPDLSCs中lncRNA-POIR的表达,4周后处死裸鼠取材,HE染色和Masson三色染色检测lncRNA-POIR在动物体内环境中对hPDLSCs和pPDLSCs成骨分化的调控作用。实验结果(1)在pPDLSCs中上调lncRNA-POIR可以促进成骨相关基因的表达,提高ALP活性,促进细胞形成更多成骨结节;反之,在pPDLSCs和hPDLSCs中下调lncRNA-POIR可以抑制成骨相关基因的表达,降低ALP活性和成骨结节形成能力。(2)HE结果显示,上调lncRNA-POIR可以促使pPDLSCs在裸鼠体内形成更多红染的骨胶原样组织;反之,下调lncRNA-POIR会抑制hPDLSCs和pPDLSCs在裸鼠体内的骨胶原形成能力;Masson染色结果和HE染色结果一致。结论上调lncRNA-POIR在体内体外环境中均可以促进pPDLSCs的成骨分化能力;下调lncRNA-POIR在体内体外环境中均可以抑制hPDLSCs和pPDLSCs的成骨分化功能。第三部分lncRNA-POIR能通过与Fox O1竞争mi R-182来调节pPDLSCs的成骨分化功能研究目的(1)验证lncRNA-POIR与mi R-182之间的相互调控作用及其调控机制;(2)验证lncRNA-POIR对靶基因Fox O1的调控作用及其调控机制;(3)验证lncRNA对pPDLSCs成骨分化的促进作用是否是通过调控Fox O1实现的。研究方法(1)q PCR观察下调mi R-182后lncRNA-POIR的表达水平以及下调lncRNA-POIR后mi R-182的表达水平;荧光素酶报告基因检测lncRNA-POIR与mi R-182之间的调控机制。(2)q PCR和Western blot观察下调mi R-182后,Fox O1的表达水平;荧光素酶报告基因检测mi R-182对Fox O1的调控机制;q PCR和Western blot观察上调或下调lncRNA-POIR后,Fox O1的表达水平。(3)利用茜素红染色,q PCR和Western blot检测下调mi R-182或Fox O1后,pPDLSCs的成骨分化能力;利用q PCR和Western blot检测si Fox O1是否可以逆转过表达lncRNA-POIR对pPDLSCs成骨分化的促进作用。实验结果(1)下调mi R-182可以提高lncRNA-POIR的表达水平;同样,下调lncRNA-POIR也可以提高mi R-182的表达水平;荧光素酶报告基因检测的结果显示,lncRNA-POIR与mi R-182之间存在直接结合。(2)下调mi R-182可以提高Fox O1的表达水平;荧光素酶报告基因检测的结果显示,mi R182与Fox O1 3‘UTR区之间存在直接结合;上调lncRNA-POIR可以促进Fox O1的表达,反之,下调lncRNA-POIR可以抑制Fox O1的表达。(3)下调mi R-182可以提高pPDLSCs的成骨分化能力,而沉默Fox O1会显著抑制pPDLSCs的骨向分化。当pPDLSCs转染si Fox O1后,过表达lncRNA-POIR不能继续促进pPDLSCs的成骨分化。结论(1)lncRNA-POIR与mi R-182可以形成负向调控的闭合环路,lncRNA-POIR是mi R-182的靶基因;(2)Fox O1是mi R-182的靶基因,受到mi R-182的负向调控;(3)lncRNA-POIR可以通过调控Fox O1的表达实现促进pPDLSCs成骨分化的作用。第四部分Fox O1调节pPDLSCs成骨分化机制的研究研究目的(1)研究Wnt/β-catenin信号通路在pPDLSCs成骨分化中的作用;(2)研究Fox O1对Wnt/β-catenin信号通路的调节作用;(3)研究Fox O1是否通过调控Wnt/β-catenin信号通路来调控pPDLSCs的成骨分化。研究方法(1)应用DKK1抑制Wnt/β-catenin信号通路的活性,观察DKK1对pPDLSCs成骨分化的影响。(2)q PCR和Western blot检测下调Fox O1后,Wnt/β-catenin信号通路下游基因cyclin D1、c-myc、Axin的表达水平,蛋白质免疫共沉淀技术检测Fox O1对β-catenin与TCF4结合的影响。(3)利用茜素红染色,q PCR检测DKK1是否可以逆转si Fox O对pPDLSCs成骨分化的抑制作用。实验结果(1)DKK1可以提高pPDLSCs中ALP水平,促进细胞的成骨分化;(2)下调Fox O1后,Wnt/β-catenin信号通路下游基因cyclin D1、c-myc、Axin的表达水平明显增加;蛋白质免疫共沉淀结果显示,si Fox O1可以提高β-catenin与TCF4的结合能力;(3)DKK1可以逆转si Fox O对pPDLSCs成骨分化的抑制作用。结论Fox O1是通过抑制经典的Wnt/β-catenin信号通路来实现其对pPDLSCs成骨分化的调控的。
【关键词】：牙周膜干细胞 炎症微环境中 长链非编码RNA microRNA 经典Wnt通路
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R781
【目录】：

• 缩略语表6-8
• 中文摘要8-14
• 英文摘要14-21
• 前言21-23
• 文献回顾23-37
• 第一部分 健康及炎症来源PDLSCs差异表达lncRNA筛选及成骨相关lncRNA的确定37-63
• 实验一 hPDLSCs与pPDLSCs的分离培养与间充质干细胞特性的鉴定38-46
• 1 主要实验试剂及仪器38-39
• 2 试验方法39-41
• 3 试验结果41-44
• 4 讨论44-46
• 试验二 hPDLSCs、pPDLSCs差异性表达lnc RNA筛选与分析46-58
• 1 主要实验试剂及仪器46-47
• 2 试验方法47-51
• 3 实验结果51-55
• 4 讨论55-58
• 试验三 pPDLSCs成骨相关lncRNA，lncRNA-POIR的确定58-63
• 1 主要实验试剂及仪器58
• 2 试验方法58-59
• 3 实验结果59-61
• 4 讨论61-63
• 第二部分 lncRNA-POIR在hPDLSCs和pPDLSCs成骨分化中调控作用的研究63-78
• 实验一 lncRNA-POIR促进hPDLSCs、pPDLSCs成骨分化的体外研究64-72
• 1 主要实验试剂及仪器64
• 2 试验方法64-67
• 3 实验结果67-71
• 4 讨论71-72
• 实验二 lncRNA-POIR促进hPDLSCs、pPDLSCs成骨分化体内研究72-78
• 1 主要实验试剂及仪器72
• 2 试验方法72-74
• 3 实验结果74-76
• 4 讨论76-78
• 第三部分 lncRNA-POIR能通过与Fox O1竞争miR-182来调节pPDLSCs的成骨分化功能78-99
• 试验一 lncRNA-POIR可以与miR-182形成调控环路发挥相互抑制的作用79-86
• 1 主要实验试剂及仪器79-80
• 2 试验方法80-83
• 3 实验结果83-85
• 4 讨论85-86
• 试验二 lncRNA通过竞争性结合miR-182来调控FoxO1的表达86-93
• 1 主要实验试剂及仪器86
• 2 试验方法86-90
• 3 实验结果90-92
• 4 讨论92-93
• 实验三 miR-182,FoxO1对pPDLSCs成骨分化作用研究93-99
• 1 主要实验试剂及仪器93
• 2 试验方法93-94
• 3 实验结果94-97
• 4 讨论97-99
• 第四部分 FoxO1调节pPDLSCs成骨分化的机制研究99-108
• 1 主要实验试剂及仪器99
• 2 试验方法99-103
• 3 实验结果103-105
• 4 讨论105-108
• 全文总结108-110
• 参考文献110-126
• 个人简历和研究成果126-127
• 致谢127-128
• 临床病例报告128-143
• 病例一129-132
• 病例二132-135
• 病例三135-138
• 病例四138-141
• 病例五141-143

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 王运涛;骨髓间充质干细胞成骨分化调控的研究进展[J];国外医学(生物医学工程分册);2003年01期

2 井燕;李良;李毅;陈孟诗;吴文超;陈槐卿;刘小菁;;力学应变对大鼠骨髓间充质干细胞增殖和成骨分化能力的影响[J];生物医学工程学杂志;2006年03期

3 崔向荣;苏伟;黄钊;覃万安;;电磁场促进骨髓间充质干细胞成骨分化的研究进展[J];中国医学物理学杂志;2011年04期

4 彭飞;郑亚东;徐西强;虞冀哲;吴华;;620nm低能量红光对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响[J];激光生物学报;2011年03期

5 赵领洲;刘丽;吴织芬;;微米坑/纳米管氧化钛形貌对骨髓间充质干细胞成骨分化的作用[J];医学争鸣;2012年04期

6 杨姣;夏雷;汤郁;陆化;费小明;;肿瘤坏死因子预处理促进骨髓间充质干细胞成骨分化潜能[J];南京医科大学学报(自然科学版);2014年03期

7 王晶;张洹;;-80℃一步法冻存对成人骨髓间充质干细胞成骨分化能力的影响[J];广东医学;2007年03期

8 陈翠平;罗新;;17β-雌二醇对大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的作用[J];中国骨质疏松杂志;2007年05期

9 ;骨髓间充质干细胞的成骨分化[J];中国组织工程研究与临床康复;2010年10期

10 吴玉琼;房兵;江凌勇;;间歇牵拉应变对大鼠骨髓间充质干细胞增殖与成骨分化的影响[J];医用生物力学;2011年06期

中国重要会议论文全文数据库 前10条

1 郑亮;郑雅元;崔燎;刘钰瑜;;四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷对大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的作用及机制研究[A];中华医学会第七次全国骨质疏松和骨矿盐疾病学术会议论文汇编[C];2013年

2 吴江;陈槐卿;K-LP.SUNG;;钛颗粒负荷影响骨髓间充质干细胞成骨分化能力的机理[A];全国首届青年复合材料学术交流会论文集[C];2007年

3 吴江;陈槐卿;李良;尹光福;K-L P．SUNG;;钛颗粒负荷影响骨髓间充质干细胞成骨分化能力的机理[A];中国复合材料学术研讨会论文集[C];2005年

4 陈海啸;洪盾;万晓晨;李继承;;肠毒素C联合维生素C对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响研究[A];2008年浙江省骨科学学术年会论文汇编[C];2008年

5 袁风红;邹耀红;高恺言;俞可佳;;地塞米松对体外人骨髓基质细胞增殖及成骨分化的影响[A];全国自身免疫性疾病专题研讨会暨第十一次全国风湿病学学术年会论文汇编[C];2006年

6 宋忠臣;束蓉;董家辰;李松;;低氧对牙周膜成纤维细胞增殖和成骨分化的影响[A];第十次全国牙周病学学术会议论文摘要汇编[C];2014年

7 董家辰;束蓉;宋忠臣;;炎症微环境对人牙周膜成纤维细胞增殖与成骨分化的影响[A];第十次全国牙周病学学术会议论文摘要汇编[C];2014年

8 孙楠;杨力;张振;张桦;陈宏;蔡德鸿;;晚期氧化蛋白产物对大鼠骨髓间充质干细胞增殖及向成骨分化的影响[A];中华医学会第十二次全国内分泌学学术会议论文汇编[C];2013年

9 马雪;孟静茹;贾敏;王宁;胡静;周颖;罗晓星;;胰高血糖素样肽-1类似物对大鼠骨髓间充质干细胞增殖与成骨分化的影响[A];第十一届全国青年药学工作者最新科研成果交流会论文集[C];2012年

10 林和敏;;成骨分化的人脐血间充质干细胞免疫原性研究[A];2013年全国激光医学学术联合会议暨2013年浙江省医学会整形美容学术年会论文汇编[C];2013年

中国博士学位论文全文数据库 前10条

1 龚逸明;microRNAs调控Satb2介导的骨髓基质干细胞成骨分化的作用研究[D];复旦大学;2014年

2 李松涛;EphB信号在轴向仿生压应力调控MSC成骨分化中的作用和机制研究[D];第三军医大学;2015年

3 方文;纯钛表面WNT信号通路调控BMSCs成骨分化的机制研究[D];浙江大学;2014年

4 刘世宇;移植外源性MSCs持久恢复宿主MSCs功能的机制研究[D];第四军医大学;2015年

5 张莉;Fgfr2~(S252W/+)小鼠骨量、骨结构特性及BMSCs成骨分化调控机制的研究[D];第三军医大学;2015年

6 刘祥舟;机械牵伸通过Wnt5a、Wnt5b/JNK信号通路促进大鼠肌腱干细胞成骨分化[D];第三军医大学;2015年

7 宋明宇;电磁场对地塞米松干预下骨髓间充质干细胞增殖分化的效应及机制研究[D];华中科技大学;2015年

8 贾杰;MiR-17-5p调控非创伤性股骨头坏死骨髓基质干细胞成骨分化与增殖的相关研究[D];华中科技大学;2015年

9 刘旭杰;材料性质调控干细胞成骨分化及壳聚糖基骨修复材料[D];清华大学;2015年

10 文采;多孔矿化水凝胶材料诱导人胚胎干细胞成骨分化的研究[D];东南大学;2015年

中国硕士学位论文全文数据库 前10条

1 吴小莹;脑源性神经营养因子对人脂肪干细胞增殖与成骨分化的作用[D];北京协和医学院;2015年

2 秦子顺;淫羊藿苷对人牙周膜干细胞的增殖和成骨分化的影响[D];兰州大学;2015年

3 孙可墨;对基因芯片中与淫羊藿苷促进牙周膜干细胞成骨分化相关长链非编码RNA的初步验证[D];兰州大学;2016年

4 钟梅;淫羊藿苷诱导人牙周膜干细胞成骨分化的长链非编码RNA表达谱分析[D];兰州大学;2016年

5 李由由;Wnt5a对根尖牙乳头干细胞体内成牙/成骨分化的影响[D];遵义医学院;2016年

6 陈坤;Wnt/β-catenin信号通路对vaspin介导的大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的影响[D];山西医科大学;2016年

7 胡东;模拟微重力下间充质干细胞骨架与粘附性改变对增殖及成骨分化的影响及机制研究[D];北京理工大学;2016年

8 陈聪;ERK5信号通路及流体剪切力在骨髓间充质干细胞成骨分化过程中作用的研究[D];兰州大学;2016年

9 朱婷;bFGF和BMP-2预处理对骨髓间充质干细胞干性维持与成骨分化潜能的差异影响[D];山东大学;2016年

10 刘璐;牵张力诱导大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化过程中miRNA表达谱分析及miR-503-5p的功能验证[D];山东大学;2016年

，

本文编号：1072877