牵张成骨中骨髓间充质干细胞迁移调控机制的研究

发布时间：2017-12-30 01:19

  本文关键词：牵张成骨中骨髓间充质干细胞迁移调控机制的研究　出处：《第四军医大学》2016年硕士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：牵张成骨(Distraction osteogenesis,DO)是一种重要组织工程技术。因其在治疗颅面部复杂畸形、缺损中的独特优势,DO广受学者们青睐,具有光明的临床应用前景。然而,目前DO的成骨机理尚未明了。研究表明,骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs)在DO新骨生成中发挥关键作用。而牵张应力下局部BMMSCs向骨截断区的迁移是DO骨再生的前提。本实验旨在探索牵张应力下,BMMSCs的分子通路改变,及相关信号分子对BMMSCs迁移的影响,并且探究调控相关信号分子对DO骨再生的影响,从而为探明骨牵张过程中BMMSCs的迁移机制提供实验依据,并为提高DO的临床效能提供理论支撑。本课题分为3个部分:第一部分牵张应力下BMMSCs应力相关信号分子的表达目的:探索BMMSCs在牵张应力下表达显著的应力相关信号分子。方法:1.1体外应用Flexcell 4000T系统对BMMSCs施加牵张力,根据对BMMSCs加力的不同,分为四组:对照组(不施加牵张力);对BMMSCs施加0.5%牵张力,持续4h;对BMMSCs施加6%的牵张力,持续4h;对BMMSCs施加10%的牵张力,持续4h。加力后,采用实时定量PCR检测目的分子p38、ERK1/2、MMPs(包括MMP2、MMP9和MMP13)、m TOR以及m TOR信号通路相关分子Raptor、p70S6K基因的表达。1.2将12只SD大鼠随机分为两组。在所有动物右侧下颌骨植入牵张器。延迟5天后,对其中一组大鼠下颌骨施行牵引(0.2mm/12h,牵引10天);另一组大鼠不进行牵张。两组大鼠均于术后15天处死,取术区下颌骨,EDTA脱钙、石蜡包埋,制作骨组织切片。进行Nestin以及p-p38免疫荧光双染。结果:结果显示,各加力组BMMSCs中p38、m TOR、Raptor、p70S6K、MMP2、MMP9和MMP13基因表达均较对照组BMMSCs上调(P0.05),然而ERK1及ERK2的基因表达没有明显变化。p38的表达变化较m TOR更为显著。BMMSCs在6%的牵张应力下,p38、m TOR等基因的表达最为明显。牵张组大鼠骨截断部位的Nestin+/p-p38+细胞数目显著高于对照组(P0.05)。结论:牵张应力下,p38及m TOR信号分子的表达升高。P38、m TOR信号通路可能参与BMMSCs的生物力学反应。p38信号通路可能发挥更为重要的作用。第二部分、牵张应力调控BMMSCs迁移能力的分子通路研究目的:探索体内、体外牵张应力对BMMSCs迁移能力的影响及参与调控的相关分子通路。方法:2.1使用Flexcell系统对BMMSCs施加牵张力(6%,4h),使用划痕实验以及Transwell迁移实验,检验牵张应力下,BMMSCs迁移能力的变化;2.2取第三代BMMSCs细胞,分为四组,分别进行如下处理:(A)应用SB203580(p38的磷酸化抑制剂)处理(20μM,2小时)后,施加牵张力(6%,4h);(B)仅进行牵张加力(6%,4h),不进行SB203580处理;(C)体外不进行牵张加力,但培养液中加入SB203580(20μM)预处理2小时;(D)对照组,不进行加力及SB203580预处理。将上述各组中BMMSCs移入Transwell小室上室中,并计数12小时后上室基底部细胞数;2.3取第三代BMMSCs细胞,分组及处理方法同2.2。提取各组BMMSCs蛋白,运用Western Blot检测各组BMMSCs p-p38、p38及MMP-2蛋白的表达;2.4取24只雄性SD大鼠,随机分为A、B、C三组。将牵张器植入各组大鼠右侧下颌骨。5天后进行牵引(0.2mm/12h,连续牵引10天)。其中A组大鼠自下颌骨牵张第一天起,于术区局部以2.5mg/kg,每天注射200μL p38激动剂Anisomycin,直至骨牵张结束;B组大鼠于牵张期每天注射200μL浓度为2.5mg/kg的p38抑制剂SB203580,C组于术区每天注射200μL的DMSO。术后15天取材:处死大鼠,取右侧下颌骨,分离骨周软组织,EDTA脱钙、包埋、切片,进行Nestin免疫组织化学染色;结果:划痕实验结果显示,牵张加力组BMMSCs较对照组48h后移动距离更远(P0.05);我们发现,12小时后加力组穿Transwell上室基底膜的BMMSCs细胞数量高于对照组(P0.05);对BMMSCs使用SB203580处理可以明显抑制BMMSCs在张应力下的迁移;Western Blot结果显示:牵张后,BMMSCs的p-p38表达升高(P0.05),而应用SB203580明显能抑制牵张应力下p-p38在BMMSCs中表达的升高;使用Nestin免疫组化染色,我们发现应用Anisomycin的大鼠骨截断区Nestin+细胞数目为各组中最多,而应用SB203580者Nestin+细胞数目最少。结论:牵张应力下p38信号分子的激活促进BMMSCs的迁移。P38介导牵张应力促BMMSCs迁移能力可能通过调控BMMSCs中MMP-2的表达而实现。第三部分干预p38信号通路对DO成骨的影响目的:探索通过干预p38信号通路的方法,以促进DO成骨能力。方法:实验分组及干预同2.4。大鼠牵张器固定2周后,取材,分别进行组织学染色及Micro CT分析。结果:组织学及Micro CT结果均显示,各组下颌骨骨痂区均有新骨生成。应用p38激动剂Anisomycin组,大鼠下颌骨痂区的新骨生成质量明显高于SB203580组(P0.05)以及对照组(P0.05);而应用p38抑制剂SB203580组大鼠下颌骨痂区的新骨生成量低于对照组(P0.05)。结论:在大鼠下颌骨DO局部应用p38激动剂能够促进新生骨痂的骨再生,这可能是通过促进体内BMMSCs的迁移能力实现的。
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【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R782.2
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本文编号：1352713