中枢神经系统内P2X3受体参与咬合干扰所致大鼠咀嚼肌疼痛的作用研究

发布时间：2018-02-21 03:24

本文关键词： 咬合干扰 P2X3受体咬肌痛觉过敏　出处：《山东大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的：口颌面部是人体比较容易产生疼痛的部位之一,相当一部分慢性疼痛的患者源于口颌面咀嚼肌疼痛,但是它的发病机制并未完全明确,咬合干扰是引起咀嚼肌疼痛致病因素之一。以往的研究显示P2X3受体在口颌面疼痛的外周及中枢的传导中起着重要的作用,但这些研究多集中于化学介质或电刺激过度收缩造成的咀嚼肌疼痛,咬合干扰引起咀嚼肌疼痛的研究较少。本研究中,我们采用抬高大鼠后牙单侧咬合的方法建立咬合干扰动物实验模型,了解咬合干扰建立后大鼠咀嚼肌机械痛阈的变化；并通过观察建立咬合干扰动物模型后P2X3受体在中枢神经系统(三叉神经脊束核尾侧亚核(Subnuclei caudalis,Vc)、中脑导水管周围灰质(midbrain periaqueductal gray, PAG)及中缝背核(dorsal raphe nucleus,DR))中的表达变化以及与大鼠咀嚼肌痛阈改变的趋势之间的关系,研究P2X3受体在Vc、PAG和DR组织中的分布特点以及在咬合干扰所致的口颌面部咀嚼肌疼痛发生发展中所起的作用,以便从脊髓及脊髓上水平的中枢神经系统探究口颌面疼痛的发生机制,为临床上治疗口颌面部疼痛提供新的方向和治疗思路。方法：1.54只8周龄雄性Wistar大鼠,随机分为6个组(每组9只),1个对照组与5个实验组,实验组大鼠建立咬合干扰动物模型,分别为建立咬合干扰模型后1天组,3天组,7天组,14天组,28天组。采用大鼠右侧下颌第一磨牙粘固3/4金属铸造冠(厚度为1.0 nm)的方法建立咬合干扰动物模型。对照组大鼠麻醉后模拟同咬合干扰组相同的操作,被动张口10分钟,但不进行金属冠的粘结。2.在建立咬合干扰模型后1,3,7,14,28天以及对照组采用Von Frey尼龙纤维对大鼠双侧咬肌进行机械疼痛分值的测量,然后分批分别取大鼠双侧Vc、PAG和DR组织对相关指标进行检测。每组3只大鼠在全麻下甲醛灌注后取双侧Vc以及PAG和DR组织固定后包埋,切片,应用免疫组织化学染色法检测并在400倍显微镜下观察计数各组织中P2X3受体免疫阳性神经元细胞数量；每组3只大鼠麻醉下分离切取完整双侧Vc以及PAG和DR组织,-80℃冷冻,应用荧光定量PCR (quantitative-PCR)法检测各组织中P2X3受体mRNA的相对表达量。每组3只大鼠麻醉下分离切取完整双侧Vc以及PAG和DR组织,-80℃冷冻,应用Western Blot技术检测各组织中P2X3受体蛋白的相对表达量。对所有数据应用SPSS17.0统计软件对对照组与各时间点咬合干扰组进行统计学分析,并将各组织中P2X3受体阳性表达与咬肌疼痛分数之间进行Spearman相关性分析(取双侧a=0.05水准,检验标准p0.05)。结果：1.建立咬合干扰模型后,咬合干扰组大鼠双侧咬肌的疼痛阈值均明显降低,痛觉过敏持续了整个实验过程。咬合干扰组大鼠双侧咬肌的疼痛分值于咬合干扰模型建立后表现出先上升后下降的趋势：建立模型后第1天咬肌的疼痛分值开始明显升高,第7天时达到最大值,接着疼痛分值逐渐下降,但仍高于对照组,差异具有统计学意义(p0.05)。虽然干扰侧大鼠咬肌的疼痛分值略高于非干扰侧,但是两者之间未见明显差异(p0.05)2.免疫组织化学结果显示：P2X3受体免疫阳性主要表达在大鼠Vc浅层、PAG外侧区和DR组织中的小型神经元细胞上(面积400μm2)。咬合干扰组大鼠双侧Vc组织中的P2X3受体阳性神经元细胞数量在建立咬合干扰模型后各时间点均明显高于对照组,而干扰侧与非干扰侧之间无明显差异(p0.05)；在建立咬合干扰模型后,咬合干扰组大鼠双侧Vc组织中的P2X3受体阳性细胞数量改变表现出先升高后降低趋势,第一天即明显升高,在第7天达到最大值,此后虽逐渐降低但仍明显高于对照组(p0.05),与咬肌疼痛分值的改变趋势一致,两者呈正相关；而咬合干扰组大鼠PAG组织中P2X3受体阳性细胞数量也在第7天明显升高,此时咬肌的疼痛分值最高,痛阈最低(p0.05),与咬肌疼痛分值的改变趋势呈正相关；而咬合干扰组大鼠DR组织中P2X3受体阳性细胞数量在第3天明显升高,第七天达到最高值,此时咬肌的疼痛分值最高,痛阈最低(p0.05),此后降低接近对照组(p0.05),与咬肌疼痛分值的改变趋势呈正相关。3.建立咬合干扰模型后,PCR结果显示：建立咬合干扰模型后1天,在咬合干扰组的双侧Vc组织中,P2X3受体mRNA的相对表达量即达到最高值随后逐渐降低,3天组、7天组、14天组均明显高于对照组,差异具有统计学意义(p0.05),28天组降至与对照组相比无统计学差异(p0.05)。但干扰侧和非干扰侧之间大鼠Vc组织内P2X3受体mRNA的相对表达量统计学无差异(p0.05)。在咬合干扰组大鼠的PAG和DR组织中,P2X3受体mRNA的相对表达量仅在第1天时高于对照组,差异具有统计学意义(p0.05)。4.建立咬合干扰模型后,Western blot结果显示：咬合干扰组大鼠的双侧Vc组织内P2X3受体蛋白的相对表达量从第1天开始即出现明显升高(p0.05),第7天时达到最大值,之后虽略有下降,但仍高于对照组(p0.05),但是干扰侧与非干扰侧之间大鼠Vc组织内P2X3受体蛋白的相对表达量无明显差异(p0.05)；在咬合干扰组大鼠的PAG和DR组织中,P2X3受体蛋白的相对表达量仅在第7天时明显升高(p0.05)。结论：1.实验性咬合干扰可以直接引起咀嚼肌的痛觉过敏。2.P2X3受体免疫阳性主要表达在Vc浅层、PAG外侧区和DR中的小型神经元细胞上。3.Vc、PAG和DR组织内的P2X3受体参与了咬合干扰所致的咀嚼肌疼痛传导的中枢神经系统敏化机制和内源性疼痛调节机制,可为临床上治疗口颌面部疼痛新的研究方向提供理论依据。
[Abstract]:Objective : To study the distribution of P2X3 receptor in the peripheral and central nervous system of rats with oral and maxillofacial pain . Results : 1 . After establishing the occlusal interference model , the number of P2X3 receptor positive cells in the rats with occlusal interference was significantly higher than that in the control group ( p < 0.05 ) . The number of P2X3 receptor positive cells in the bilateral Vc group was higher than that of the control group ( p < 0.05 ) . Conclusion : 1 . The expression of P2X3 receptor protein is significantly higher than that in the 7th day ( p < 0.05 ) . Conclusion : 1 . The experimental occlusal interference can directly cause the pain sensitivity of the chewing muscles . The P2X3 receptor is mainly expressed in the small neuronal cells in the Vc shallow , PAG and DR . The P2X3 receptors in the PAG and DR tissues are involved in the central nervous system sensitization mechanism and the endogenous pain regulation mechanism caused by the occlusal interference , which can provide theoretical basis for the new research direction of the maxillofacial pain in clinic .

【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R782

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