不同杀菌剂对根尖外多细菌生物膜作用的体外研究

发布时间：2018-10-25 15:51

【摘要】：根尖周病是口腔临床的常见病，，目前最有效的治疗方法是根管治疗术，其原理是清除根管系统内的感染，从而促进根尖周病变组织的愈合。临床中有一些由于解剖结构复杂、感染微生物种类特殊等原因会导致根管治疗失败，这些病例绝大多数可以通过根管再治疗术或根尖外科手术得到解决。其中，某些病例出现根尖外的微生物感染，形成根尖外生物膜，就必需通过根尖切除倒充填的外科手术方法进行治疗。为了能够彻底去除根尖外生物膜，根尖外科手术要求切除根尖约3mm的牙体组织，这样势必会影响牙齿的抗力。能否采用物理、化学的手段（非机械切除）清除根尖外生物膜，从而达到既能清除感染，又能最大限度地保留牙体组织的目的呢？国内外学者往往将这种通过根管治疗、甚至再治疗都难以控制的根尖周病称为难治性根尖周病，研究表明衣氏放线菌、血液链球菌、粪肠球菌均为革兰阳性兼性厌氧菌，在难治性根尖周病的根尖生物膜内能够检出，放线菌能造成慢性的根尖放线菌病，血链球菌是牙周和心脏疾病中常见的细菌。粪肠球菌的耐受力和抵抗性强，所以在难治性根尖周病中亦是常见菌，在临床切除的根尖组织或拔除的患牙根尖部的微生物学研究结果显示，难治性根尖周病往往根尖外生物膜是以这三种细菌为主的混合细菌生物膜。强酸性电解质水（SAEW）、次氯酸钠（NaClO）、洗必泰（CHX)，是临床根管治疗中常用的根管内消毒溶液，强酸性电质水是电离分解盐水得到，生物相容性较好。次氯酸钠是有很强杀菌并破坏分解细菌和有机物质的化学药品，广泛的在根管冲洗中使用。洗必泰和次氯酸钠能力相似，但杀菌作用稍弱，在漱口水的成分中常可见到。人β防御素-3（rHBD-3）为一种宿主防御肽，是新型的杀菌药物，可杀灭多种细菌，特别是耐药菌，但作为杀菌液使用的报道还不多。这几种杀菌剂虽然有报道能分别杀灭或抑制体外单独培养的上述三种细菌，次氯酸钠、洗必泰和强酸性电解质水还能有效清除根管内的生物膜，那么它们和新型的人β防御素-3能否清除根尖外生物膜，尤其是三种细菌混合的根尖外生物膜呢？迄今为止仍鲜见报道。因此，我们试图探索三种细菌共培养的体外模式，建立根尖牙骨质上三种细菌的混合生物膜，并观察次氯酸钠、洗必泰和强酸性电解质水以及人β防御素-3对根尖牙骨质上混合细菌生物膜的作用，为难治性根尖周病的治疗提供新的临床思路。研究分两部分：一根尖多细菌生物膜的培养先将三种细菌，血链球菌、粪肠球菌、衣氏放线菌，分别在1/2牛心脑浸液（BHI）琼脂培养基和BHI培养基中中进行共同培养，观察三种细菌形成的菌落间是否有相互抑制。之后将三种菌接种在96孔板上，结晶紫染色观察生物膜的生长情况取96孔板将置于37℃厌氧培养箱中进行培养48h用结晶紫染色法观察单菌种生物膜成膜情况，分别于培养后24、48、54、56、58、70、76、82、94、106小时，每个时间点终止培养，用三蒸水冲洗3次后每孔加入250μl的乙醇溶液固定30min；固定结束后弃原液，分别用1g/L结晶紫染色5min；330ml/L冰醋酸洗去染液后，用酶标仪分别测定570nm波长处的OD值，观察生物膜的生长曲线。三种细菌共同在根尖牙骨质片上培养5天后，用25ml/L戊二醛溶液在4℃固定过夜，500ml/L、600ml/L、750ml/L850ml/L、950ml/L、1000ml/L乙腈梯度脱水、干燥、喷金、扫描电镜观察并拍照。以上实验提示三种不同的细菌可以共同良好的生长，接菌顺序和方法会对其生长有一定影响。二不同杀菌液对多细菌生物膜作用的研究在上一实验的基础上，对接种好的牙骨质片和细胞爬片分别用强酸性电解质水（SAEW）、不同浓度（5g/L和10g/L）次氯酸钠（NaClO）溶液、（50mg/L、100mg/L、800mg/L）抗菌肽（rHBD-3）溶液、（2g/L、10g/L、20g/L）洗必泰（CHX）溶液，处理15秒、1分钟和5分钟，52.5g/L NaClO溶液和生理盐水分别为阳性对照和阴性对照；各组处理结束后。样本固定干燥、脱水、喷金后进行扫描电镜观察；另外用活死菌染色剂处理，激光共聚焦显微镜下观察杀菌效果，并用ImageJ软件分析各组的杀菌效率。各实验组和阳性对照组在各处理时间点的活菌比例均显著低于阴性对照组（P0．05），其中SAEW/15s组，5g/L/NaClO15s、1min、5min组，10g/L/NaClO15s、1min组，50、100、800mg/L/rHBD-3/15s、1min、5min组的活菌比例均明显高于阳性对照组(P0．05)；而SEAW，10g/L次氯酸钠、20g/L洗必泰1min、5min处理组与52．5g/L次氯酸钠溶液各时间段处理组相比活菌比例均无统计学差异(P0．05)。结论：强酸性电解质水和高浓度的次氯酸钠和洗必泰都能有效杀灭根尖外牙骨质上多细菌生物膜中的细菌，抗菌肽对其也有一定作用。考虑到高浓度次氯酸钠的强刺激性和洗必泰易引起过敏和局部染色的因素，强酸性电解质水在这方面有着广阔的应用前景。
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【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R781.34

【参考文献】