牙龈成纤维细胞成骨能力的体外及体内研究

发布时间：2018-11-01 12:46

【摘要】：目的:1.体外分离培养人牙龈成纤维细胞(human gingival fibroblasts,HGFs),检测骨向诱导的HGFs在健康根片和牙周病根片上的附着、细胞活性以及成骨分化能力,观察骨形态发生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2,BMP-2)联合地塞米松(dexamethasone,DEX)对其的作用情况。2.将成骨诱导后的HGFs与Bio-Oss骨粉复合,观察其对裸鼠颅骨缺损的成骨修复效果,以及BMP-2联合DEX的作用。3.制作成骨诱导后HGFs细胞膜片,将其植入到裸鼠颅骨缺损处,观察其对颅骨缺损的成骨修复效果,以及BMP-2联合DEX的作用,为HGFs以及细胞因子在牙周组织再生的应用提供实验证据。方法:1.制备约4 mm×4 mm×1 mm大小的健康和病变牙根片,采用组织块法培养牙龈成纤维细胞,培养到第三代后用于后续实验。实验分为三组,分别是成骨诱导A组,成骨诱导B组,无诱导N组(对照组)。A组:骨诱导培养基(达尔伯克氏必需基本培养基(dulbecco's minimum essential medium,DMEM)、3%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、5 mg/L抗坏血酸、10-3 mol/Lβ-甘油磷酸钠以及2×10-3 mol/L L-谷氨酰胺),10-8 mol/L DEX和50 ng/mL BMP-2;B组:骨诱导培养基;N组:DMEM和3%FBS。将HGFs接种到健康、病变根片上,于实验设计的时间点用血细胞计数板计数根片上附着的细胞数,四甲基偶氮唑盐(3-4,5-dimethylthiazol-2-yl-5-3-carboxymethoxyphenyl-2-4-sulfophenyl-2H-tetrazo lium,inner salt,MTS)比色法检测根面上细胞活性,扫描电镜检测细胞在根片上附着情况,对硝基苯基磷酸二钠(p-nitrophenol phosphate,PNPP)法定量和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色检测各组细胞碱性磷酸酶活性,茜素红染色检测各组细胞钙结节形成。2.构建裸鼠颅骨缺损模型,将三组细胞与Bio-Oss骨粉复合,分别植入到裸鼠颅骨缺损模型中,6周后取材进行HE染色,检测各组复合物的颅骨缺损修复情况。3.构建三组HGFs细胞膜片,植入到裸鼠颅骨缺损处,6周后取材进行HE染色,检测各组膜片的颅骨缺损修复情况。结果:1.培养至1、3、5、7天,BMP-2联合DEX诱导的HGFs在根片上细胞数量明显多于普通诱导组和对照组(P0.05),健康根片上附着的细胞数量明显多于病变根片上的细胞(P0.05)。2.培养至3、5、7天,BMP-2联合DEX诱导的HGFs在根片上细胞活性明显高于普通诱导组和对照组(P0.05),健康根片上附着的细胞活性明显高于病变根片上的细胞(P0.05)。3.扫描电镜结果显示:培养至3、7天,BMP-2联合DEX诱导的HGFs附着在根片上细胞数量明显多于普通诱导组和对照组,健康根片上附着的细胞数量明显多于病变根片上的细胞。4.PNPP结果:培养至1、3、5、7天:BMP-2联合DEX诱导的HGFs在根片上ALP活性明显高于普通诱导组和对照组(P0.05),健康根片上附着的细胞ALP活性明显强于病变根片组(P0.05)。培养7天时ALP染色显示BMP-2联合DEX诱导组蓝紫色沉淀最明显,培养21天时茜素红染色显示BMP-2联合DEX诱导组红色沉淀最明显。5.细胞+Bio-oss体内实验中HE染色结果显示:A组及B组颅骨缺损处可见大量的条索状、网状基质形成。而C组缺损处仅见少量基质形成。计量学结果:成骨诱导组基质面积比明显大于无成骨诱导组,且A组基质面积比大于B组(P0.05)。6.三组细胞膜片经21天左右成型。HE染色结果显示成骨诱导细胞膜片组缺损边缘可见大量条索状、网状基质形成。而非诱导细胞膜片组缺损处仅见少量基质形成。计量学结果:成骨诱导组基质面积比明显大于无成骨诱导组,且A组基质面积比大于B组(P0.05)。结论:1.牙周病变根片影响HGFs的附着、细胞活性以及成骨分化。2.骨诱导的HGFs能在根面上粘附以及成骨分化。3.无论在健康根片还是病变根片上,BMP-2联合DEX可明显促进HGFs在根面上的附着、细胞活性以及成骨分化。4.HGFs骨诱导后,特别是BMP-2联合DEX诱导,会促进颅骨缺损区基质形成,为进一步成骨提供必要条件。
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【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R781.4

【参考文献】