Ⅱ型糖尿病微环境影响下BMAL1调控BMSCs成骨分化的机制研究

发布时间：2018-11-15 20:34

【摘要】：背景:慢性牙周炎是具有较高发病率、以菌斑为始动因子的炎性疾病,侵袭破坏牙龈、牙周膜、牙槽骨等牙周组织,致使其再生能力下降甚至丧失,不仅可造成患牙松动脱落,还可诱发糖尿病、心血管疾病等系统性疾病,严重危害口腔乃至全身健康。Ⅱ型糖尿病是以胰岛素抵抗和β细胞功能紊乱为发病机理的系统性代谢性疾病,另外还与牙周炎双向作用从而影响口腔健康。Ⅱ型糖尿病不仅参与改变牙周组织炎症微环境,还会引起牙周骨组织代谢异常,造成骨形成和骨吸收失衡,骨稳态紊乱,从而加快牙周骨质流失。骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)是骨组织代谢或骨改建的细胞学基础。Ⅱ型糖尿病微环境下BMSCs的生物学特征受到一定影响,例如Ⅱ型糖尿病显著抑制BMSCs成骨分化,是形成糖尿病性骨缺损、牙周炎恶化的重要原因。因此,探究Ⅱ型糖尿病影响BMSCs成骨分化的机制,在此基础上进行调控,恢复其成骨能力,延缓骨组织的退行性改变,重构骨组织正常的形态和功能,为糖尿病性牙周炎治疗提供新方法。编码芳香烃受体核转运蛋白 l(brain and muscle aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator-like protein 1,BMAL1)是机体近日节律基因家族的核心组件,影响体内一系列生理病理反应,例如维持正常的血糖代谢和促进BMSCs成骨分化。因此,BMAL1可能对Ⅱ型糖尿病条件下BMSCs成骨分化能力起到积极作用,而Ⅱ型糖尿病条件下BMAL1调控BMSCs成骨分化机制的研究罕有报道。经典Wnt/β-catenin信号通路是调控BMSCs成骨分化的重要通路之一。BMAL1已被证实与经典Wnt/β-catenin信号通路密切相关,然而BMAL1调控经典Wnt/β-catenin信号通路活性及功能有待深入研究。糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase, GSK-3β)不但与Ⅱ型糖尿病相互影响,还是经典Wnt/β-catenin信号通路的重要负向调控因子。本课题组前期已证实高糖微环境下GSK-3β活性增强进而抑制BMSCs的迁移。此外,GSK-3β与BMAL1之间的相互关系也是研究热点。前期研究认为GSK-3β通过磷酸化BMAL1使其泛素化,影响BMAL1蛋白质的稳定性以及节律表达。但是BMAL1也可以通过某些通路间接影响GSK-3β磷酸化。因此,本课题推断在Ⅱ型糖尿病病理微环境下BMAL1可能通过GSK-3β改变经典Wnt/β-catenin信号通路活性从而影响BMSCs的成骨分化。目的:本课题拟探讨Ⅱ型糖尿病条件下BMAL1通过经典Wnt/β-catenin信号通路调控BMSCs成骨分化的具体机制,探究BMAL1干预恢复Ⅱ型糖尿病条件下BMSCs的生物学功能及骨再生能力的可能性,对糖尿病性牙周炎的病因学研究、延缓Ⅱ型糖尿病性骨组织损伤进而恢复和重建牙周骨组织形态和功能奠定理论基础。方法:第一部分:自8周龄至12周龄连续测定GK大鼠和Wistar大鼠的体重、随机血糖、空腹血糖和空腹胰岛素,筛选构建自发性非肥胖性Ⅱ型糖尿病GK大鼠模型。处死GK大鼠和Wistar大鼠后,自大鼠股骨分离获得BMSCs。应用流式细胞仪技术检测两种来源干细胞的表面分子标志物。干细胞具有多向分化能力,为了比较两组BMSCs分化能力差异,对两组BMSCs进行成脂以及成骨诱导分化实验,应用qRT-PCR检测成骨以及成脂的关键基因RUNX2、OCN和PPARγ、LPL。为检测两组BMSCs衰老程度差异,本课题对两组干细胞进行SA-β-gal染色并应用qRT-PCR检测相对端粒长度和端粒酶活性。为比较两组BMSCs的增殖和凋亡,本课题检测其克隆形成率,应用MTT法以及流式细胞仪进行细胞活性的检测。应用qRT-PCR检测两组BMSCs中增殖相关因子CCND1、CDK4和炎性因子IL-1β、TNF-αmRNA表达水平。第二部分:应用Western blot检测GK大鼠和Wistar大鼠BMSCs总蛋白中BMAL1的表达。GK大鼠和Wistar大鼠BMSCs成骨诱导7天后,应用Western blot检测GK大鼠和Wistar大鼠BMSCs成骨诱导前后细胞核蛋白中BMAL1的表达,按照上述分组应用qRT-PCR检测BMSCs成骨诱导前后BMAL1 mRNA表达水平。其次,本课题探究Ⅱ型糖尿病条件下BMAL1表达变化对BMSCs成骨分化能力的影响。GK大鼠和Wistar大鼠BMSCs成骨诱导7天后,应用ALP染色、ALP活性检测以及qRT-PCR从不同角度比较两组干细胞的成骨分化能力。第三部分:应用细胞免疫荧光技术检测GK大鼠和Wistar大鼠BMSCs中GSK-3β的表达,同时应用Western blot定量比较两组干细胞成骨诱导前后细胞质蛋白中GSK-3β的表达水平。其次,应用Western blot检测GK大鼠和Wistar大鼠BMSCs成骨诱导前后细胞质蛋白中act-β-catenin以及细胞核蛋白中β-catenin、NLK、TCF的表达水平。为验证Ⅱ型糖尿病通过BMAL1影响GSK-3β表达及经典Wnt/β-catenin信号通路活性,首先本课题构建BMAL1过表达慢病毒载体并转染至两组BMSCs,应用流式细胞技术对转染效率进行测定,应用Western blot和qRT-PCR检测两组BMSCs转染前后BMAL1蛋白及mRNA的表达水平。然后应用细胞免疫荧光技术检测BMAL1过表达载体转染后GK大鼠和Wistar大鼠BMSCs中GSK-3β的表达,并应用Western blot定量测定两组干细胞转染前后细胞质蛋白中GSK-3β、act-β-catenin、β-catenin的表达变化。其次本课题应用GSK-3β抑制剂CHIR99021抑制GK组BMSCs中GSK-3β活性,应用Western blot检测Wistar组、GK组、GK-CHIR组BMSCs细胞质蛋白中GSK-3β、BMAL1、act-β-catenin以及细胞核蛋白中NLK、TCF的表达变化。同时应用CHIR99021抑制BMAL1过表达的GK组BMSCs中GSK-3β活性,应用Western blot检测细胞质蛋白中GSK-3β、β-catenin、act-β-catenin以及细胞核蛋白中TCF的表达变化。第四部分:为验证Ⅱ型糖尿病条件下BMAL1过表达有效恢复BMSCs成骨分化的作用,本课题首先应用细胞免疫荧光技术检测BMAL1过表达并成骨诱导7天后GK大鼠BMSCs中成骨标记物OCN的表达变化。同时应用ALP染色和qRT-PCR从不同角度检测GK大鼠和Wistar大鼠干细胞BMAL1过表达并成骨诱导后RUNX2、OCN、ALP的表达水平。本课题还应用qRT-PCR检测BMAL1过表达后GK大鼠和Wistar大鼠BMSCs中IL-1β、TNF-αmRNA表达水平。结果:第一部分:Ⅱ型糖尿病条件下BMSCs生物学特征的变化1、以空腹血糖大于11.1mmol/L或OGTT实验120min后血糖大于16.7mmol/L为标准,本课题Ⅱ型糖尿病GK大鼠模型建模成功率为83.3%,10只12周龄GK大鼠表现出稳定的Ⅱ型糖尿病症状。2、GK组和Wistar组BMSCs均呈长梭形克隆化生长,表面标记物表达无显著性差异:阳性表达 CD90、CD105、CD146 和 Stro-1,阴性表达 CD14 和 CD31。3、GK组BMSCs的成脂和成骨化能力显著低于Wistar组BMSCs。4、GK组BMSCs SA-β-Gal染色、端粒相对长度和端粒酶活性与Wistar组BMSCs比较无显著差异。5、GK组BMSCs的克隆形成及细胞增殖能力显著低于Wistar组BMSCs,但是促炎因子IL-1β、TNF-αmRNA表达水平显著高于Wistar组BMSCs。第二部分:Ⅱ型糖尿病条件下BMAL1影响BMSCs成骨分化1、GK组BMSCs总蛋白中BMAL1表达水平显著低于Wistar组BMSCs。2、GK组BMSCs成骨诱导7天后BMAL1蛋白及mRNA表达水平较常规培养显著增高,但显著低于相应Wistar组BMSCs。3、与Ⅱ型糖尿病条件下BMAL1的表达变化相对应,两组BMSCs成骨诱导7天后GK组ALP染色面积及ALP相对活性显著低于Wistar组。4、qRT-PCR 结果显示 GK 组 BMSCs 成骨诱导 7 天后 ALP、OCN、RUNX2 mRNA较诱导前显著增高,但显著低于Wistar组BMSCs。第三部分:Ⅱ型糖尿病条件下BMAL1通过GSK-3β调控经典Wnt/β-catenin信号通路活性1、细胞免疫荧光实验显示GK组BMSCs中GSK-3ββ阳性表达率显著高于Wistar组BMSCs。2、GK组BMSCs成骨诱导后GSK-3β蛋白表达水平显著降低,但明显高于Wistar组BMSCs 。3、GK组BMSCs中细胞质蛋白act-β-catenin、细胞核蛋白β-catenin、TCF表达趋势与GSK-3β相反,即成骨诱导后显著增强但明显低于Wistar组,但是细胞核蛋白NLK表达趋势与GSK-3β相同。4、BMAL1过表达载体以较高效率转染至GK组BMSCs后,GK组干细胞中BMAL1蛋白及mRNA表达水平显著增强。5、BMAL1过表达后GK组BMSCs中GSK-3β阳性表达率明显降低。6、BMAL1过表达后GK组BMSCs细胞质蛋白中GSK-3β表达水平显著降低,但仍高于 Wistar 组 BMSCs;但 act-β-catenin、β-catenin 表达趋势与 GSK-3β 相反。7、应用CHIR99021后,GK组BMSCs细胞质蛋白中GSK-3β表达水平显著降低,但是act-β-catenin、BMAL1表达水平无显著变化,而细胞核蛋白中NLK、TCF表达水平显著增强。8、BMAL1过表达后再应用CHIR99021, GK组BMSCs细胞质蛋白中BMAL1较转染后无显著差异,但是细胞质蛋白中act-β-catenin、β-catenin、细胞核蛋白中TCF均有明显变化。第四部分:Ⅱ型糖尿病条件下BMAL1过表达恢复BMSCs成骨分化能力1、BMAL1过表达后GK组BMSCs中OCN阳性表达率增高,ALP染色深度以及OCN、RUNX2mRNA表达水平明显增强。2、BMAL1过表达后GK组BMSCs中TNF-α mRNA表达水平明显降低,但IL-1β无明显变化。结论:1、Ⅱ型糖尿病显著抑制BMSCs的增殖能力以及多向分化潜能。2、Ⅱ型糖尿病条件下干细胞中BMAL1表达下调是导致BMSCs成骨分化能力降低的重要原因。3、Ⅱ型糖尿病抑制BMAL1表达,继而BMAL1对GSK-3β的负向调控作用减弱,降低经典Wnt/β-catenin信号通路活性,最终抑制BMSCs成骨分化能力。4、Ⅱ型糖尿病条件下上调BMSCs中BMAL1表达,可以有效抑制GSK-3β表达、恢复经典Wnt/β-catenin信号通路活性,促进BMSCs成骨分化,为Ⅱ型糖尿病条件下延缓骨组织破坏、恢复和重建其形态功能奠定实验基础。
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【学位授予单位】：中国人民解放军医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R781.42;R587.2

【参考文献】

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1 左晓虹;蔡彦宁;李宁;刘姝;张燕莉;陈彪;;小鼠纹状体时钟基因表达的生后发育[J];中华行为医学与脑科学杂志;2009年05期

2 孟焕新;;牙周炎与糖尿病的关系[J];北京大学学报(医学版);2007年01期

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本文编号：2334380