【摘要】：龋病是由含糖饮食、致龋细菌和易感宿主在时间的催化作用下导致牙体组织被破坏而机体不可自然修复的一种慢性感染疾病。变异链球菌(Streptococcus mutans,S.mutans)作为典型的口腔主要致龋细菌,能黏附在牙齿表面,代谢蔗糖产酸破坏牙釉质,并与其他细菌共聚粘附在牙齿表面形成牙菌斑生物膜。抑制S.mutans以其生物膜的形成能够有效预防龋齿。本研究通过体外筛选对S.mutans及其生物膜形成具有抑制作用的乳酸菌,考察目的菌株对S.mutans生物膜形成的具体影响、在口腔中的益生特性及安全性,并在大鼠龋齿模型中验证其防龋效果,为益生菌防治龋病提供前期理论基础和依据。论文的主要研究内容包括:(1)抑制S.mutans生长及其生物膜形成乳酸菌的分离筛选从健康人及龋病病人的唾液、牙菌斑和口腔粘膜、健康人粪便以及新鲜蔬菜叶等样品中分离出93株乳酸菌,通过牛津杯琼脂扩散法考察这些菌株对S.mutans的抑菌性,选择抑菌圈直径大于15 mm的12株菌,研究它们与S.mutans共培养24 h对S.mutans生物膜形成的影响,发现为部分乳酸菌促进S.mutans的生物膜形成,部分则抑制。(2)乳酸菌相关菌体性质的测定测定12株菌的自聚和共聚能力、自身生物膜形成能力、表面疏水性和表面酸碱电荷,通过主成分分析法(Principal Component Analysis,PCA)分析得到一株综合性质良好的菌株FB-T9。该菌株可使S.mutans生物膜形成量减少60.33%,而且其自身生物膜形成能力弱(OD600=0.295),2 h和4 h的自聚力分别为28.52%和35.09%,与S.mutans的共聚力分别为8.69%和15.26%,表面疏水性、表面酸电荷和表面碱电荷分别为52.98%、34.52%和20.32%,经16S r DNA鉴定菌株FB-T9为植物乳杆菌。(3)植物乳杆菌FB-T9不同时期介导对S.mutans生物膜形成的影响考察在不同时期L.plantarum FB-T9介导对S.mutans生物膜形成的影响,结果发现L.plantarum FB-T9在S.mutans生物膜形成的初期(12 h)、中期(24 h)和成熟后期(48h)分别进行介导,可将S.mutans的生物膜形成量分别降低44.41%、40.43%和23.84%;L.plantarum FB-T9在S.mutans生物膜形成前期的介导效果最佳,能显著抑制S.mutans前期的粘附和定植;L.plantarum FB-T9不同时期的介导将S.mutans生物膜中的菌体总面积分别降低了66.83%、50.24%和19.57%,生物膜活性分别降低了36.96%、53.69%和60.96%。因此FB-T9越早介导,越有利于抑制S.mutans生物膜的形成。(4)植物乳杆菌FB-T9的口腔应用特性的测定为考察L.plantarum FB-T9在口腔中的应用特性,体外测定了L.plantarum FB-T9对唾液包裹的羟磷灰石的黏附率,发现其对牙面的黏附率(32.93%)显著低于S.mutans69.13%的黏附率,说明它对牙面的酸蚀风险较低。研究结果显示L.plantarum FB-T9对溶菌酶的最高耐受浓度为1.2 mg/mL,远高出人口腔唾液中溶菌酶的浓度(0~57μg/mL),表明该菌株具备在口腔环境中良好存活的能力。(5)植物乳杆菌FB-T9预防大鼠龋齿效果的评价利用大鼠龋齿模型进一步验证L.plantarum FB-T9的防龋特性。动物实验中选择洗必泰(醋酸氯己定溶液)作为阳性药物对照,选择筛菌过程中对S.mutans生物膜形成表现为促进作用的另外一株L.plantarum 5D-3作为阴性对照。在实验的前5天连续每天对大鼠牙齿擦拭0.2 mL 1×108 CFU/m L浓度的S.mutans菌悬液感染大鼠口腔,建立口腔龋齿模型。在动物实验的早期、中期和晚期对大鼠口腔中的总菌群水平计数,发现大鼠口腔总细菌数维持在2~10×105 CFU/m L的范围,说明实验过程中大鼠口腔总菌群数量相对稳定。干预组中L.plantarum FB-T9可将大鼠口腔中的S.mutans水平显著降低两个数量级,而预防组中L.plantarum FB-T9的早期定植能抑制S.mutans的水平在4×103CFU/mL左右的范围,且L.plantarum FB-T9在口腔中的保留能力显著高于L.plantarum5D-3(P0.05);对大鼠龋齿打分结果分析可知植物乳杆菌L.plantarum FB-T9相对于空白对照组,能减少大鼠磨牙釉质龋(E)和牙本质浅龋(Ds)的发生(P0.05),并对牙本质中龋(Dm)起到一定的缓解,在治疗和预防龋齿上的作用效果强于L.plantarum5D-3。综上研究结果,从健康人粪便中分离得到的L.plantarum FB-T9具有防治龋病的相关特性,可以作为防治口腔龋病的潜在益生菌。
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【学位授予单位】：江南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R781.1
【参考文献】
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2464970
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