分化抗原147和小凹蛋白1在口腔中的研究

发布时间：2019-05-29 13:58

【摘要】：口腔为消化管道的起始部分,并且与呼吸道相通,同时与大脑相邻,具有咀嚼、吞咽和言语等功能。口腔疾病常常会影响人们的生活质量甚至会危及生命,现已越来越受到人们的重视。牙周炎是一种受多因素影响的慢性感染性疾病,同时也是导致失牙的重要原因,为口腔中的常见病和多发病。牙周炎病理特征包含了牙槽骨的破坏和细胞外基质(extracellular matrix, ECM)的降解。口腔鳞状细胞癌是口腔中最常见的一种恶性肿瘤,发病率较高且伴随着年龄的增长有升高的趋势。其中ECM和基底膜的降解是口腔上皮增生以及癌变的关键步骤。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)是一组Zn2+依赖的内源性肽酶,在ECM降解的过程中起着重要的作用,为炎症对组织的破坏以及癌变组织的浸润和转移提供便利。分化抗原147/白细胞分化抗原147(cluster of differentiation147,CD147)是一种细胞表面跨膜糖蛋白,又名细胞外基质金属蛋白酶诱导因子(extracellular matrix metalloproteinase inducer, EMMPRIN),属免疫球蛋白超家族成员。CD147的一个重要的功能就是诱导MMPs的产生,从而参与众多机体的生理和病理的发生发展过程。经我组成员的多年研究,我们发现了宿主因素中CD147-MMPs-牙周炎这一路径的存在,以及这一路径与牙周炎症程度之间可能存在一定的联系,为宿主因素参与牙周炎的致病提供了一个证据。与此同时多个研究证实CD147与炎症,增生,癌前病变和癌症的发生和发展也有着重要的联系。 CD147细胞外段包含有2个免疫球蛋白结构,分别具有诱导MMPs产生和结合小凹蛋白1(caveolin-1)的能力。同时CD147胞外区域还包含了3个N端糖基化位点,不同组织不同状态下的CD147,其糖基化形式也有所不同,可出现高糖基化和低糖基化形式的蛋白。由于糖基化程度不同的影响,CD147的分子量约在35kDa至65kDa之间。重要的是,高糖基化形式的CD147(high glycoforms CD147, HG-CD147)而不是低糖基化形式的CD147(low glycoforms CD147, LG-CD147)才具备诱导产生MMPs的能力。小凹(caveolae)是细胞质膜表面直径约为50-100nm的特异性的内陷微区,参与多种细胞生命活动。Caveolin-1是caveolae的重要结构蛋白,主要表达于上皮细胞,内皮细胞,成纤维细胞,脂肪细胞,肌细胞等。Caveolin-1参与细胞中分子的转运和信号的传导。Caveolin-1与CD147结合后使CD147的糖基化过程受阻,从而导致CD147自聚集和对MMPs诱导能力的降低。同时研究也发现caveolin-1可以抑制MMPs的表达,其中部分研究推测是因为caveolin-1抑制CD147糖基化而引起的。Caveolin-1的基因多态性还与乳腺癌,膀胱癌,白血病,Alzheimer's病和开角型青光眼等多种疾病的易感性有关。至今尚未发现CD147的糖基化以及caveolin-1在牙周组织和动物实验性粘膜上皮病变组织中的表达及相互作用的研究报道。同时CD147与caveolin-1相互作用是否存在于牙周组织的病理生理过程中,以及是否存在于药物诱导的金黄地鼠颊囊正常上皮→单纯增生→异常增生→鳞状细胞癌这一过程中亦不清楚,这一方面的研究将有助于进一步揭示CD147与caveolin-1在牙周炎和上皮组织癌变中的作用机制。编码caveolin-1的基因多态性是否与牙周炎有关目前也尚不清楚。实验一拟通过研究CD147的糖基化以及CD147和caveolin-1在牙周组织中的共表达和相互作用,了解CD147和caveolin-1对牙周炎的影响。实验二试图从基因层面上探寻CAV1(编码caveolin-1基因的检索名称)单核苷酸多态性是否与重度牙周炎易感性有关。实验三是在实验一明确了CD147和caveolin-1共表达于口腔上皮细胞的基础上,通过动物实验研究CD147和caveolin-1相互作用在口腔上皮组织病变过程中的意义。实验一人牙龈组织中CD147的糖基化和caveolin-1的表达目的：研究CD147的糖基化和caveolin-1在正常和重度牙周炎人牙龈组织中的表达以及对MMPs产生的影响。材料和方法：收集10例正常人和15例重度牙周炎患者的牙龈。将牙龈组织分为两部分,一部分用于进行免疫组化和免疫荧光检测,另一部分用于进行Western blot检测。通过免疫组化方法检测CD147, caveolin-1, MMP-1, MMP-8和MMP-13在牙龈组织中的表达分布。用免疫荧光双标方法检测CD147和caveolin-1在牙龈组织中的共同定位。用Western blot方法检测CD147的糖基化情况以及caveolin-1, MMP-1,MMP-8和MMP-13在牙龈组织中的表达含量。采用T检验进行两组间比较,双变量相关分析两两因素之间的相关性。结果：免疫组化发现CD147表达于牙龈上皮细胞、浸润的炎性细胞、成纤维样细胞和内皮细胞。Caveolin-1表达于牙龈上皮细胞、内皮细胞、成纤维样细胞。CD147和caveolin-1共定位于牙龈上皮细胞、内皮细胞、成纤维样细胞的细胞膜上。与正常的组织相比,HG-CD147,活性MMP-1,前体MMP-8(proMMP-8)和proMMP-13在重度牙周炎组织中表达增高(p0.05)。活性的MMP-1, proMMP-1和proMMP-13蛋白表达水平分别与HG-CD147的蛋白表达水平呈正相关(p0.05)。结论：在正常和重度牙周炎的牙龈组织当中存在不同糖基化形式的CD147以及CD147和caveolin-1的共同定位,活性的MMP-1, proMMP-1和proMMP-13蛋白表达水平的升高很可能与HG-CD147的蛋白表达水平的升高有关实验二CAV1基因多态性与重度牙周炎易感性的相关性研究目的：本研究通过检测健康至轻度牙周炎和重度牙周炎患者的CAV1单核苷酸多态性(Single-nucleotide polymorphism, SNP)分型情况,探索CAV1的SNP是否与重度牙周炎易感性相关。材料和方法：收集汉族人种的外周血液,113名健康至轻度牙周炎患者作为对照组,128名重度牙周炎患者作为疾病组。使用SNPbrowser4.0软件筛选出CAV1基因标签SNP (tagging SNP) rs3779512, rs3807986, rs4730751, rs3807989, rs729949,rs1049337。提取外周静脉血DNA,使用时间飞行质谱(MALDI-TOF-MS)检测技术,对CAV1的6个待测核苷酸位点进行SNP分型,比较两组间SNP的分布是否存在差异。运用基因型分析,等位基因分析、显性模型分析和隐性模型分析方法来统计目的SNP位点在疾病组和对照组中分布是否存在差异。运用HAPLO-VIEW3.32软件检测目标SNP位点是否存在单倍体型。结果：所研究的SNP位点：rs3779512, rs3807986, rs4730751, rs3807989, rs729949和rs1049337均存在多态性,分别依次为T/G, G/A, A/C, A/G, A/G和C/T,其低频等位基因频率(minor allele frequencies, MAF)依次为7.84%,22.65%,0.90%,27.97%,20.89%,45.74%。分别运用基因型分析,趋势分析、显性模型分析和隐性模型分析方法发现rs3779512, rs3807986, rs4730751, rs3807989, rs729949和rs1049337位点的SNP在疾病组和对照组中的分布均无统计学差异。单倍体型分析显示位点：rs3807989、rs729949和rs1049337组成一个了单倍体型∥检验此单倍体型的多种组成方式在疾病组和对照组中的分布均无统计学差异。结论：所检测CAV1的SNP位点并未发现与汉族重度牙周炎易感性相关。实验_-CD147和caveolin-1在口腔鳞状细胞癌中的表达以及相互作用目的：观察CD147和caveolin-1在药物诱导的金黄地鼠颊囊上皮从正常→单纯增生→异常增生→鳞状细胞癌这一过程中的表达模式,并探索这两者与MMP-2和MMP-9之间的关系。材料和方法：实验金黄地鼠随机分成五组每组十只：用0.5%的9,10-二甲基-1,2-苯并蒽(9,10-dimethyl-1,2-benzanthracene, DMBA)均匀涂抹于金黄地鼠左侧颊囊表面,一周3次,分别作用0、4、8、10、13周。待最后一次DMBA作用后3天,同时处死金黄地鼠。取左侧颊囊处口腔上皮组织,将其分为两部分,一部分用于进行免疫组化检测CD147和caveolin-1的表达,另一部分用于Western blot检测CD147和caveolin-1的蛋白表达水平以及明胶酶谱检测具有降解明胶活性的MMP2和MMP-9蛋白表达水平。结果：免疫组化检测结果显示CD147在健康上皮组织中呈阴性或弱阳性着色,随着上皮组织病变的加重CD147的表达明显增强。与之相反的是,caveolin-1在健康上皮组织中呈强阳性着色,随着上皮组织病变的加重caveolin-1的表达减弱。Western blot和明胶酶谱检测显示,随着上皮组织病变的加重,CD147、MMP-2和MMP-9的蛋白表达水平逐渐增加,而caveolin-1的蛋白表达水平逐渐降低。CD147与caveolin-1的蛋白表达水平呈负相关,MMP-2和MMP-9分别与CD147蛋白表达水平呈正相关,与caveolin-1蛋白表达水平呈负相关。结论：CD147和caveolin-1表达于不同时期的上皮细胞膜上,并存在着几乎相反的表达模式,推测CD147和caveolin-1相互作用可能存在于口腔上皮病变的不同病理时期中,caveolin-1对CD147、MMP-2和MMP-9很有可能起着负性调节作用。综上所述,实验一发现了CD147在牙周组织中确实存在着不同的糖基化程度,同时发现了CD147和caveolin-1的共定位主要位于牙龈上皮细胞,血管内皮细胞和牙龈成纤维细胞的细胞膜上,提示在牙周炎的病理过程中CD147和caveolin-1可能存在相互作用,验证了HG-CD147而不是LG-CD147’蛋白水平的升高可能影响MMP-1和MMP-13的表达。实验二从基因的角度研究了CAV1的基因多态性与汉族人重度牙周炎易感性之间的关系,但并未发现明显的联系。实验三在实验一的基础上,进一步证实了CD147和caveolin-1的相互作用很有可能存在于口腔上皮组织的生理病理过程中,进而影响MMPs的表达。这三个实验尝试从不同的角度探索CD147和caveolin-1之间的关系,并研究了它们与牙周炎和口腔鳞状细胞癌之间可能存在的关系。
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【学位授予单位】：武汉大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R781.4

【参考文献】