釉原蛋白基因cDNA克

发布时间：2020-04-13 19:20

【摘要】：牙釉质是哺乳动物体内最硬的组织，其确切的生物矿化机制目前尚不清楚。而釉原蛋白(Amelogenin，Am)是由成釉细胞合成和分泌的细胞外釉基质蛋白，它在釉质的生物矿化过程中起着启动(牙釉质的矿化)、调节(羟基磷灰石晶体的大小)、控制(晶体生长速度)和支架的关键性作用。Am的基因克隆是近年来国际上研究的一个热门课题，但在对大鼠和人牙的研究中采用成年大鼠切牙和欧洲人牙cDNA库为对象。而釉原蛋白的cDNA由于交叉剪切和酶的作用，不同国家的人其cDNA序列并不一致，所以研究中国人釉原蛋白cDNA序列意义重大；同时本课题取材于正在发育中的新生大鼠与中国人胚胎牙胚组织，采用与组织切片对照的方法，应用分子生物学技术，对大鼠与中国人Am的基因进行了克隆，原核表达和纯化，制备了抗釉原蛋白抗体，标记了基因探针，进行了蛋白印记(Westernblot)、免疫组化和原位杂交的研究，并对釉原蛋白的一些相关功能作了初步的研究。从分子水平和蛋白水平探讨了釉原蛋白的组织表达特异性，为进一步研究釉质的生物矿化机理与功能和今后的临床应用奠定了基础。 一、纯系Wistar大鼠与中国人牙釉原蛋白cDNA的克隆和序列分析 采用异硫氰酸胍一步法从新生纯系Wistar大鼠、五月龄女性胎儿牙胚组织中抽提总RNA，用特异性Oligo (dt)作引物逆转录合成牙胚cDNA；分别设计一对引物进行PCR，扩增出大鼠和中国人的Am cDNA基因片段；将扩增的基因片段插入pBluescript KS (pBS)质粒载体，转化到大肠杆菌JM109，挑选阳性克隆并鉴定，用PE317-A型自动测序仪进行
【图文】：

A260A/280=2.0/1.9。总RNA的浓度为1.753/1.579(pg/pl);所提的总RNA浓度和纯度都较标准。总RNA琼脂糖凝胶电泳结果显示285带亮度约为185带的2倍，，表明所获得的RNA无明显降解(图1.1)。图1.1牙胚组织总RNA琼脂糖凝胶电泳(l%)右:大鼠左:人

图1.21.0%琼脂糖凝胶电泳(Ra)t1、3:PCR产物，2:入DN户JEcoRI+HindlllMarkers图1.31.0%琼脂糖凝胶电泳(Human)一:一00bPMarker:2.PCR产物
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2000
【分类号】：R78

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本文编号：2626340