β2肾上腺素能受体阻滞剂对口腔鳞状细胞癌干细胞增殖迁移侵袭的作用机制研究

发布时间：2020-04-21 03:37

【摘要】：目的:研究β1肾上腺素能受体(β1-AR)及β2肾上腺素能受体(β2-AR)在CD133~+口腔鳞状细胞癌(OSCC)干细胞、OSCC细胞系Cal-27、SAS、SCC-9及正常口腔黏膜细胞中的表达;研究阻滞β2-AR对CD133~+OSCC干细胞与OSCC细胞系增殖、迁移及侵袭的影响;以基因高通量测序筛选β2-AR被阻滞及β2-AR未被阻滞的CD133~+OSCC干细胞的差异表达基因,从基因转录组层面和基因表达方向探究β2-AR与OSCC肿瘤干细胞在口腔鳞状细胞癌的发生发展中所发挥的作用。方法:应用胰蛋白酶消化的方法对正常口腔黏膜的鳞状上皮细胞进行原代细胞培养。同时应用实时荧光定量PCR及Western Blot技术测定β1-AR与β2-AR在6例CD133~+OSCC干细胞、3例OSCC细胞系(Cal27、SAS及SCC9)及6例正常口腔黏膜上皮细胞中的表达。应用Cell Counting Kit-8(CCK-8)实验方法研究不同浓度的β2-AR特异阻滞剂ICI118,551对3例CD133~+OSCC干细胞和2例OSCC细胞系(SAS及SCC9)增殖的影响。然后以集落形成实验检测β2-AR特异阻滞剂ICI118,551对CD133~+OSCC干细胞单细胞增殖能力的影响。而后采用细胞划痕实验探究不同浓度的β2-AR特异阻滞剂ICI118,551对CD133~+OSCC干细胞和OSCC细胞系SCC9迁移的影响。再以Transwell实验研究不同浓度的β2-AR特异阻滞剂ICI118,551对CD133~+OSCC干细胞和OSCC细胞系SCC9侵袭的影响。最终通过基因高通量测序技术构建β2-AR受到阻滞与未受到阻滞的CD133~+OSCC干细胞的差异表达基因谱,并应用Gene Ontology(GO)富集分析和KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)通路富集分析对筛选得到的表达明显差异的基因进行功能分析。结果:实时荧光定量PCR及Western Blot结果发现β1-AR与β2-AR在CD133~+OSCC干细胞组、OSCC细胞系(Cal27、SAS及SCC9)的表达均高于正常口腔黏膜上皮细胞组。CCK-8实验结果显示CD133~+OSCC干细胞与SCC9、SAS在不同浓度的ICI118,551药物作用48小时后,药物浓度越高则细胞的存活率越低,0.1μM、0.5μM、1μM、2.5μM及5μM与0μM比较,各药物浓度间的细胞存活率差异均具有统计学意义(P0.01)。集落形成实验结果显示加药组3个孔集落数(个)分别为30、30及32,集落形成率(%)为61.33±2.31(n=3);对照组3个孔集落数(个)分别为34、35及37,集落形成率(%)为70.67±3.06(n=3),差异具有统计学意义(P0.05)。细胞划痕实验结果示SCC9及CD133~+OSCC干细胞的迁移率随药物ICI118,551的浓度的上调而逐渐下降(P0.05);药物浓度为0.1μM、0.5μM、1μM、2.5μM、5μM及7.5μM时SCC9及CD133~+OSCC干细胞的迁移率与药物浓度为0μM时的迁移率比较具有统计学意义(P0.05)。Transwell实验结果示SCC9及CD133~+OSCC干细胞的侵袭率随药物ICI118,551的浓度的上调而逐渐下降(P0.05);药物浓度为0.1μM、0.5μM、1μM、2.5μM、5μM、7.5μM与10μM时SCC9及CD133~+OSCC干细胞的侵袭率与药物浓度为0μM时的侵袭率比较具有统计学意义(P0.05)。基因高通量测序在加药组和对照组中筛选得到994个差异表达基因,其中用药后有237个基因表达上调,757个基因表达下调。经GO分析,差异表达基因注释到分子功能(Molecular Function,MF)的有118类,注释到细胞组分(Cellular Component,CC)的有92类、注释到生物学进程(Biological Process,BP)的有856类。KEGG分析结果显示差异表达基因富集于细胞周期、MAPK信号通路、癌症相关微小RNA、癌症相关通路、PI3K-Akt信号通路与Ras信号通路等19条信号通路。结论:β1-AR及β2-AR在CD133~+OSCC干细胞、OSCC细胞系中的表达均显著高于正常口腔黏膜细胞。阻滞β2-AR可抑制CD133~+OSCC干细胞、OSCC细胞系的增殖、迁移及侵袭能力。阻滞β2-AR后,CD133~+OSCC干细胞发生显著变化的基因主要富集于组织发育(tissue development)、细胞增殖(cell proliferation)、上皮细胞分化(epithelial cell differentiation)、细胞迁移(cell migration)及细胞运动(cell motility)等生物进程;并且这些差异表达的基因可能在一定程度上通过MAPK、PI3K/Akt与Ras等信号通路参与OSCC的发生与发展。
【图文】：

图3-1口腔正常黏膜上皮细胞的培养。5天后于4×10倍镜下观察(a),14天后于4×10倍镜下观察 (b),21天后于 4×10 倍镜下观察(c), 21 天后于 10×10 倍镜下观察(d)Figure.3-1 Culture of normal oral mucosal epithelial cells. Observation under 4 x 10-fold microscope after5 days (a); Observation under 4 x 10-fold microscope after 14 days (b); Observation under 4 x 10-foldmicroscope after 21 days (c) ; Observation under 10 x 10-fold microscope after 21 days (d).

腺素受体阻滞剂对口腔鳞状细胞癌干细胞增殖迁移侵袭的作用机制研究 β1-AR 的 mRNA 在口腔鳞状细胞癌 CD133+干细胞、口腔 Cal27、SCC9 及 SAS 和正常口腔黏膜上皮细胞中均有表达量分别为 3.66±0.37、7.70±0.38、18.06±0.91、1.45±0.1 3-2，β1-AR 的 mRNA 在口腔鳞状细胞癌 CD133+干细胞黏膜上皮细胞，差异具有统计学意义（P＜0.001）；β腔鳞状细胞癌细胞系 Cal27 中的表达高于口腔黏膜上皮学意义（P＜0.001）；β1-AR 的 mRNA 在口腔鳞状细胞表达高于口腔黏膜上皮细胞，，差异具有统计学意义（P＜RNA 在口腔鳞状细胞癌细胞系 SAS 中的表达高于口腔具有统计学意义（P＜0.01）。
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R739.8

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本文编号：2635315