细胞一步法PCR新技术揭示口腔癌细胞线粒体DNA氧化损伤、修复和细胞毒性的动态变化过程

发布时间：2020-05-03 12:49

【摘要】：目的肿瘤细胞氧化压力的增高是导致线粒体和mt DNA病理改变的重要原因,但是活性氧自由基与mt DNA损伤及后续的生物学效应的关系还不清楚。本实验利用细胞一步法定量PCR新方法分析和比较外源性活性氧(reactive oxygen species,ROS)和活性氮(reactive nitrogen species,RNS)诱发肿瘤细胞mt DNA损伤和修复、拷贝数变化和细胞毒性反应的异同及动态变化过程。方法选用口腔癌中发病率较高,恶性程度较强的口腔鳞状细胞癌SCC-25细胞株为实验模型,利用细胞一步法裂解和超螺旋敏感性定量PCR(ss-q PCR)的方法同时分析和比较外源ROS和RNS诱发肿瘤细胞mt DNA损伤的效应,论证两类不同活性自由基分子的异同。ROS以五个浓度H2O2(60-960μM),四个时间点(20 min,1 h,24 h,48 h)诱导细胞出现氧化损伤反应,RNS用林西多明(3-morpholino-sydnonimine,SIN-1)五个浓度(0.25-1 m M),四个时间点(1h,6 h,24 h,48 h)诱导细胞出现氧化损伤反应。通过ss-q PCR方法测定mt DNA损伤、修复的动态过程,细胞一步法微滴式数字PCR(dd PCR)方法用于测定细胞mt DNA拷贝数改变,MTT方法测定细胞活性与生长抑制,单细胞克隆实验测定10天细胞存活率。结果本研究建立了细胞一步法定量PCR分析技术,即细胞裂解后直接用于PCR,完全避免DNA的提取与纯化,从而可在96-孔板中进行高通量快速分析。我们用实验证明细胞一步法样本处理不仅可与ss-q PCR结合进行mt DNA损伤与修复的快速分析,而且可与dd PCR结合进行细胞内mt DNA拷贝数变化的绝对定量分析。利用细胞一步法ss-q PCR和dd PCR方法,本研究系统性分析了外源性H2O2诱发SCC-25口腔癌细胞mt DNA损伤、修复和拷贝数改变的动态变化过程,揭示出一个十分敏感的早期mt DNA损伤反应,一个区分可恢复性和不可逆性mt DNA损伤的阈值剂量;高剂量H2O2诱发的不可逆性mt DNA损伤是导致mt DNA拷贝数下降和细胞严重生长抑制和毒性的主要诱因之一,而mt DNA低剂量的可恢复性则与单细胞克隆的10天存活率相关。此外,我们首次证明外源性SIN-1(一个常用的过氧亚硝基阴离子(ONOO-)供体)可以在SCC-25细胞诱发一个早期剂量依赖性mt DNA损伤的增高,但是与H2O2不同,高剂量SIN-1诱发的不可逆损伤并不伴随mt DNA拷贝数的改变。表明SIN-1可能通过与H2O2不同的机制诱发mt DNA的损伤。结论本研究建立的细胞一步法ss-q PCR和dd PCR分析方法为mt DNA的损伤、修复和拷贝数变化的系统分析提供了一个强有力的新技术平台。本研究揭示了外源性H2O2可在SCC-25口腔癌细胞诱发一个十分独特的mt DNA损伤、修复和拷贝数改变的动态变化过程,早期mt DNA损伤的程度和类型决定或指示后续细胞急性毒性和慢性存活率的不同应答反应。我们首次证明SIN-1可以在SCC-25细胞诱发一个早期剂量依赖性mt DNA损伤的增高,但与H2O2的作用方式不同。表明SIN-1可能通过与H2O2不同的机制诱发mt DNA的损伤和细胞毒性。
【图文】：

实验流程,肿瘤细胞,细胞,工作液

图 1 氧化刺激诱发 SCC-25 肿瘤细胞 mtDNA 损伤和突变的实验流程图2、PCR 检测 SCC-25 细胞 H2O2刺激损伤修复及拷贝数变化实验步骤（1）细胞铺板细胞计数，取 1x106细胞 1 ml 加入 9 ml 细胞培养液中，制成浓度为 1x105/ ml的 stock1。Stock1 中取 5 ml 溶入 10 ml 细胞培养液中，制成浓度约为 53333 cells/ ml 的工作液。工作液中每孔取 150 μl 即 33333x0.15=5000 个细胞，摇晃混匀，一列一列加。每板 6 个剂量，每个剂量 3 个重复细胞样本。加完标记，，放于孵箱37℃，5% CO2条件培养，26 h 后刺激。（2）刺激处理刺激时间为20 min、1 h、24 h、48 h。刺激剂量为0 μM、60 μM、120 μM、240 μM、480 μM、960 μM。（3）样本收集及检测

扩增曲线,口腔癌,细胞线粒体,一步法

本之间 2 倍的差别，在对照样本中获得 mtDNA 损伤基值低、重复性好且不受细胞数量影响的定量分析结果，为基于 96-孔板的高通量分析提供了可行性。图2 细胞一步法 qPCR 分析不同数量SCC-25 口腔癌细胞线粒体DNA 的扩增曲线与 Ct 值注：箭头所指扩增曲线分别为 500、1000、2000、4000 和 8000 个 SCC-25 口腔癌细胞样本，Ct 值为扩增曲线与基值交汇处的 PCR 循环数，NTC 代表无模板阴性对照。Y 轴代表扩增子荧光强度（ Rn），X 轴代表定量 PCR 循环次数（cycle）。
【学位授予单位】：锦州医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R739.8

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