N-花生四烯酸氨基乙醇调控人成牙本质样细胞MMP-2表达相关miRNA的研究

发布时间：2020-05-08 13:29

【摘要】：目的:大麻素(cannabinoids,CBs)系统作为人体内主要的神经化学系统,具有广泛的生物学效应,包括镇痛、神经保护、免疫和内分泌等。N-花生四烯酸氨基乙醇(arachidonyl ethanolamide,AEA)是目前发现的主要内源性大麻素(endogenous cannabinoids,EC)样物质之一,AEA通过与大麻素受体结合发挥作用,具有重要的生物学功能,不仅可以诱导组织的毒性刺激,还可以促进炎症和组织修复。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMPs)在多种炎症性疾病的基质降解中起着重要作用,主要降解细胞外基质内胶原和蛋白等多种成分,目前研究认为其分类之一MMP-2是参与牙髓和根尖周病变的重要致病因子。课题组前期已证实人成牙本质细胞(human odontoblasts,HODs)上大麻素受体1型(cannabinoid type1 receptor,CB1)的功能性表达,因此AEA可能在HODs中发挥调控功能。本实验利用体外建立的HODs样细胞模型,首先观察AEA在HODs样细胞中对MMP-2蛋白表达发挥的调控作用,其次探寻调控作用发生的潜在分子机制,预测和验证调控MMP-2表达相关的微小核糖核酸(micro ribonuclenic acid,mi RNA),进一步验证mi RNA在AEA调控HODs样细胞MMP-2表达的过程中发挥关键作用。本研究旨在探讨内源性大麻素AEA调控HODs样细胞MMP-2表达相关的mi RNA,为今后牙髓病和根尖周病临床治疗奠定一些实验基础。方法:本实验通过About I等人建立的方法诱导HODs样细胞,利用免疫荧光(immunofluorescence,IF)和实时荧光定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,q PCR)分析特异性标志物牙本质涎磷蛋白(Dentin sialophosphoproteins,DSPP)和牙本质巢蛋白(nestin)表达来鉴定培养的HODs样细胞。用10mmol/L AEA作用HODs样细胞0、12、24、48、72h后通过Western blot(WB)分析MMP-2的蛋白水平随时间变化趋势,再用不同浓度AEA作用HODs样细胞一定时间后通过WB分析MMP-2蛋白水平随AEA浓度变化趋势。为了研究调控MMP-2表达的潜在分子机制,通过靶基因预测软件Target Scan和mi RDB预测并筛选出目标mi RNA与MMP-2结合区域,根据结合区域碱基序列构建野生型和突变型增强绿色荧光(enhanced green fluorescent protein,EGFP)MMP-2 3'UTR质粒、预测的mi RNA过表达质粒和反义寡核苷酸(antisense oligonucleotides,ASO)mi RNA,进行EGFP报告载体实验验证预测的mi RNA是否可以直接靶向作用MMP-2 3'UTR。为了进一步验证预测的mi RNA对MMP-2表达有调控作用,在HODs样细胞中过表达或封闭预测的mi RNA后通过q PCR和WB检测MMP-2的表达水平,从而确定预测的mi RNA可以调控MMP-2表达。在上述研究的基础上,进一步通过挽救实验来分析AEA、过表达预测的mi RNA和MMP-2表达的相关性,通过q PCR和WB检测MMP-2的表达水平来分析预测的mi RNA过表达后AEA的调控变化,从而确定调控发生的分子机制。结果:IF和q PCR结果显示培养的细胞中DSPP和nestin呈阳性表达,鉴定为HODs样细胞可用于后续实验。WB结果显示10mmol/L AEA作用HODs样细胞24h后MMP-2蛋白水平开始明显上调,72h后达到与阳性对照(TNF-α)相当的水平,证实MMP-2蛋白水平与AEA作用时间呈正相关,以72 h作用上调效果最明显;不同浓度AEA作用HODs样细胞72h后,10mmol/L AEA处理组最先达到与阳性对照(TNF-α)相当的水平,12mmol/L AEA处理组达到蛋白水平最高峰,证实随着AEA浓度的增加MMP-2蛋白水平上调越明显。靶基因预测软件Target Scan和mi RDB预测并筛选出MMP-2为mi R-136的靶基因,EGFP报告载体实验结果显示过表达mi R-136使野生型EGFP-MMP2 3′-UTR质粒荧光强度显著降低,封闭mi R-136使野生型EGFP-MMP2 3′-UTR质粒荧光强度增加;然而,过表达mi R-136或封闭mi R-136对突变型EGFP-MMP2 3′-UTR质粒荧光强度没有明显变化,证实mi R-136能够直接靶向作用于野生型MMP-2 3′-UTR。q PCR和WB结果显示HODs样细胞中过表达mi R-136后MMP-2的m RNA和蛋白水平显著降低,封闭mi R-136后MMP-2的m RNA和蛋白水平升高,说明mi R-136可对MMP-2表达进行转录后调控。AEA作用HODs样细胞不同时间后,q PCR结果显示AEA下调mi R-136表达水平;HODs样细胞过表达mi R-136后再进行AEA处理,q PCR和WB实验结果显示单独过表达mi R-136能下调MMP-2的m RNA和蛋白水平,单纯AEA处理能上调MMP-2的m RNA和蛋白水平,而过表达mi R-136+AEA处理可以部分上调MMP-2的m RNA和蛋白水平,证实AEA可以部分解除HODs样细胞中由过表达mi R-136介导的MMP-2表达抑制作用。结论:该研究表明AEA可显著上调HODs样细胞中MMP-2的表达水平;AEA通过mi R-136来调控HODs样细胞中MMP-2的表达。
【图文】：

3)按说明将试剂盒中的 A 液和 B 液按体积 1:1 混合 1min，然后滴到膜上4)放置胶片，曝光时间为 1～5min，曝光结束后，立马放入显影液内，条纹明显显示后结束，过程一般为 1～2min。5)显影结束后，将胶片转移到定影液内，等胶片透明后结束，过程通常5～10min，用流水清洗后在常温下吸干。（8） 凝胶图象分析：采用扫描仪将胶片上图像进行扫描，并用凝胶图象处系统分析所需要的条纹。1.2 结果1.2.1 HODs 样细胞的鉴定结果IF 染色显示人牙髓组织培养并诱导获得的细胞中 DSPP（绿色）和 nest（绿色）呈阳性表达（图 1A 和 F）。qPCR 结果显示细胞中 DSPP 和 nestin 的 mR表达水平高（图 1G），证实培养获得的细胞为 HODs 样细胞，可用于后续实验究。

天津医科大学硕士学位论文1.2.2 AEA 调控 HODs 样细胞 MMP-2 表达上调首先通过 WB 分析 AEA 对 HODs 样细胞 MMP-2 表达的影响，结果发现 10 mol/LAEA 作用 HODs 样细胞 24h 后 MMP-2 的蛋白水平明显上调，上调水平与时间呈正相关，72h 后上调到与阳性对照组（GAPDH）相当的水平（图 1.2A）。其次检测不同浓度 AEA 作用 HODs 样细胞 72 小时后 MMP-2 的蛋白水平，结果发现随着 AEA浓度增加，MMP-2 蛋白水平上调越明显，，10 mol/LAEA 处理组最先上调至阳性对照组（GAPDH）相当的水平，12 mol/LAEA 处理组上调效果达到最高峰（图 1.2B）。
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R781

【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 周怡君;刘苍维;闫广兴;王爽爽;叶佳朋;张雪;胡月;郝新青;史册;孙宏晨;;活化蛋白A受体1在成牙本质细胞极化和牙本质形成中的作用[J];口腔颌面外科杂志;2019年06期

2 Wang HS;Yang FH;Wang YJ;赵泽亮;;成牙本质细胞外泌体减轻邻近细胞凋亡[J];中国口腔颌面外科杂志;2019年06期

3 赵颖煊;赵守亮;唐荣银;吕海鹏;闫晶;侯锐;;人成牙本质细胞L型钙离子通道特异性基因片段的克隆研究[J];牙体牙髓牙周病学杂志;2008年04期

4 宋玮,赵守亮,石勇,何文喜;人成牙本质细胞的分离和鉴定[J];牙体牙髓牙周病学杂志;2005年02期

5 崔春,陈智;基膜及其相关分子在成牙本质细胞分化中的作用[J];国外医学.口腔医学分册;2004年01期

6 王晓春,梁景平;成牙本质细胞分离技术的新进展[J];国外医学.口腔医学分册;2004年06期

7 李明伟;李鹏;陈博;白玉;程庚;薛云鹏;肖敏;余擎;;脂多糖对成牙本质细胞细胞连接影响的体外研究[J];牙体牙髓牙周病学杂志;2014年04期

8 姜永;肖明振;杨帆;何文喜;范晓敏;;成牙本质细胞中成纤维细胞生长因子18的表达[J];中国临床康复;2006年37期

9 王捍国,肖明振,赵守亮,郝建军,张进;永生化人成牙本质细胞样细胞系的建立[J];第四军医大学学报;2003年10期

10 王发生;;钠钙交换体1型通道蛋白在人牙髓成牙本质细胞和神经纤维组织中的表达[J];中国民康医学;2016年17期

相关会议论文 前10条

1 吕海鹏;赵守亮;史俊南;Athony J.Smith;;人成牙本质细胞L型钙离子通道α1亚基D亚型特异性基因的原核表达质粒的构建和鉴定[A];全国第三次牙体牙髓病学临床技术研讨会论文汇编[C];2009年

2 田卫东;谢家敏;刘磊;汤炜;郑晓辉;李声伟;;人类牙乳头间充质细胞向成牙本质细胞定向诱导分化的实验研究[A];2007年第七次全国牙体牙髓病学学术会议论文集[C];2007年

3 裴斐;;自噬调节成牙本质细胞分化及牙本质形成[A];2019第九次全国口腔生物医学学术年会论文汇编[C];2019年

4 郝玉庆;王国荃;刘开泰;;过量氟对培养人牙乳头间充质细胞合成分泌Ⅰ型胶原的影响[A];新世纪预防医学面临的挑战——中华预防医学会首届学术年会论文摘要集[C];2002年

5 朱晓茹;赵守亮;唐荣银;张蓉;李玉成;;人牙切片器官培养模型的建立[A];2007年第七次全国牙体牙髓病学学术会议论文集[C];2007年

6 贺丹;吴丽更;阙克华;;内源性大麻素AEA调控HODs细胞分泌MMP-2的机制[A];第十次全国老年口腔医学学术年会论文汇编[C];2015年

7 谢家敏;田卫东;陈希哲;郑晓辉;汤炜;刘磊;;体外诱导人牙乳头间充质细胞向成牙本质细胞样细胞分化[A];2004年中国口腔颌面修复重建外科学术会议论文汇编[C];2004年

8 陈智;;成牙本质细胞分化的调控机制—Klf4及其表观遗传因子的作用[A];2014年第九次全国牙体牙髓病学学术会议论文汇编[C];2014年

9 占云燕;裴斐;陈智;;HDAC6通过调控自噬体与溶酶体融合影响自噬过程参与成牙本质细胞分化[A];2019第九次全国口腔生物医学学术年会论文汇编[C];2019年

10 郝新青;周怡君;胡月;刘苍维;闫广兴;王爽爽;史册;孙宏晨;;极性蛋白PAR3在小鼠下颌磨牙成牙本质细胞中的表达浅析[A];2019年中华口腔医学会口腔病理学专业委员会第十三次全国口腔病理学术会议论文汇编[C];2019年

相关重要报纸文章 前2条

1 洪亚兰;厌食蔬菜对健康的危害[N];医药养生保健报;2007年

2 记者 杨念明　通讯员 龙华 实习生 文金汇;我省5个课题入选国家973前期专项[N];湖北日报;2010年

相关博士学位论文 前10条

1 万春燕;基质金属蛋白酶-9在小鼠根尖周炎/牙周炎中的作用以及牙本质涎蛋白调控成牙本质细胞分化的研究[D];武汉大学;2015年

2 贾杰;Dspp突变打破小鼠成牙本质细胞分化过程的矿化平衡机制研究[D];武汉大学;2016年

3 刘钊;HDAC抑制剂LMK-235对DPCs成牙本质细胞向分化的作用及机制的研究[D];南方医科大学;2017年

4 李霞;TRAF6对成牙本质细胞功能的调控作用的研究[D];第四军医大学;2005年

5 姜永;成纤维细胞生长因子18对成牙本质细胞分化的作用及信号传导通路的研究[D];第四军医大学;2006年

6 陈新梅;甲状旁腺激素对牙乳头间充质细胞、组织影响的实验研究[D];第四军医大学;1998年

7 李玉成;组织工程化牙根组织的研究[D];第四军医大学;2007年

8 何文喜;Smads信号分子在成牙本质细胞分化中作用的研究[D];中国人民解放军第四军医大学;2003年

9 黄欣;成牙本质细胞分化中microRNA靶向调控牙本质涎磷蛋白基因的研究[D];南方医科大学;2011年

10 韩娜娜;β-catenin在牙髓细胞向成牙本质细胞方向分化过程中的作用机制研究[D];武汉大学;2014年

相关硕士学位论文 前10条

1 文静;N-花生四烯酸氨基乙醇调控人成牙本质样细胞MMP-2表达相关miRNA的研究[D];天津医科大学;2019年

2 王瑜;TRPA1、TRPV1与TMEM100三种蛋白在人成牙本质细胞中共表达的研究[D];天津医科大学;2019年

3 谢金芳;Matrilin-4对大鼠牙髓损伤后的修复作用[D];吉林大学;2019年

4 袁芳;SLPI在成牙本质细胞分化中的作用和机制研究[D];昆明理工大学;2018年

5 李媛;FoxO3a调控自噬参与成牙本质细胞炎性损伤修复的机制研究[D];武汉大学;2018年

6 宋玮;人成牙本质细胞的分离和鉴定[D];第四军医大学;2005年

7 吴煜;过量氟对大鼠牙髓成牙本质细胞超微结构的影响及免疫组化的研究[D];广西医科大学;2005年

8 赵颖煊;人成牙本质细胞L型钙离子通道α_1亚基D亚型特异性基因的克隆研究[D];第四军医大学;2008年

9 段晴月;骨髓间充质干细胞分化为成牙本质细胞的体内研究[D];第四军医大学;2010年

10 朱晓茹;人成牙本质细胞L型钙离子通道α_1亚基对牙本质矿化的影响研究[D];第四军医大学;2007年

本文编号：2654713