牙龈卟啉单胞菌高毒力株W83致病基因筛选

发布时间：2020-05-10 11:02

【摘要】：目的本研究通过抑制消减杂交技术(Supression Subtractive Hybridization,SSH)对比牙龈卟啉单胞菌高毒力株W83与低毒力株标准参考菌ATCC33277的基因差异,建立差异消减文库,经PCR筛选鉴定阳性克隆,进而对部分片段进行测序和同源分析。从全基因角度研究牙龈卟啉单胞菌高毒株W83与标准株ATCC 33277之间的分子遗传差异。同时结合基因芯片技术对临床患者口腔中牙龈卟啉单胞菌进行筛查,可以为牙龈卟啉单胞菌致病基因的筛选提供依据,为今后牙周病预防、诊治的靶标提供理论依据。材料与方法 1.研究对象的选择:实验组选择慢性牙周炎者50例,对照组选择牙周健康,年龄,性别与实验组具可比性者20例。所有受试者均无全身系统性疾病,未接受牙周系统治疗,近3个月未服用抗生素,无吸烟史,知情同意。 2.记录牙周指数:所有检查内容均由同一检查者完成。选择牙周炎患者口腔中病变较重的部位与健康或仅存在轻度龈炎的部位、牙周健康者的健康部位,记录探诊出血指数(Bleeding on Probing,BOP),牙周探诊深度(Probing Depth,PD),临床附着丧失(Clinical Attachment Loss,CAL)及牙齿松动度(Tooth Movement,TM)。 3.样本采集及细菌培养:用灭菌龈下刮治器取被检牙位龈下菌斑,置于转送液(TD液)中10倍稀释后立即接种于BHI培养基上培养,经分离、传代、固体液体增菌、生化鉴定后收集菌体。 4.Porphyromonas gingivalis的检测:用试剂盒提取DNA,用P.gingivalis 16S rRNA特异引物PCR扩增,1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。
【图文】：

电泳图,电泳,接头连接,株基

几al酶切后的W83基因组DNA(tester)和ATcC33277株基因组DNA电泳图片显示呈现smaer状条带，范围在0.1一2场之间，符合本实验要求，如图1所示。M:l加bPDNA肠dderMa政er图1;1:W83DNA酶切后;2:ATCC33277DNA酶切后Rasl酶切后的电泳结果二、SSH结果1、接头连接效率检测:如图2所示，在2、4泳道扩增出大小在400-soobp的片段，经Blast分析，输人尸.梦ngi二115特异性引物上游，剪贴一段尸.9￡ng初alsi基因序列，通过NEBCutter查找离上游引物最近的Rsal酶

电泳图,电泳图,产物,效率分析

2、消减及PcR结果:上述RSal酶切的etster分别与daaptorl和daPaotrZR连接产物与变性driver进行2轮消减和2轮CPR得到消减CPR混和物。如图3所示，，消减之前的etsterPcR产物和消减后的PcR产物电泳图谱带型明显不同。后者的差异强化带代表etster独有而driver缺如的片段。M:loobpDNAI』dderM毗er;1:第一次PCR产物2:第二次PCR产物图3消减后的PcR产物电泳图3、消减效率检测按照操作程序进行消减效率分析，结果见图4。
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2006
【分类号】：R780.2

【参考文献】