乳腺丝氨酸蛋白酶抑制剂对口腔扁平苔藓炎性反应的作用

发布时间：2020-05-19 14:16

【摘要】：目的:口腔扁平苔藓(OLP)是一种慢性炎症性疾病,其病因和发病机制尚不清楚。IκB激酶α(Ikkα)调节的乳腺丝氨酸蛋白酶抑制剂(MASPIN)已被证明参与了慢性炎症过程,但MASPIN对OLP慢性炎性反应的作用尚不清楚。因此,本研究的目的是探讨MASPIN在OLP中的表达及其在炎症反应中的作用。材料与方法:免疫组化染色和实时荧光定量PCR(Real-time PCR)分别检测OLP及健康对照组中MASPIN、Ikkα的亚细胞定位和表达情况;酶联免疫吸附试验(ELISA)比较OLP及健康对照组中炎性细胞因子(TNF-α,IL-6)的水平。脂多糖(LPS)刺激人口腔角质细胞(HOKs)部分模拟OLP炎性环境,使用CCK8和ELISA实验分别检测LPS对HOKs的毒性作用和LPS刺激HOKs后炎性细胞因子(TNF-α,IL-6)的表达情况,进而确定LPS刺激HOKs的最佳浓度;随后将实验分为四组:分别是实验组(MASPIN plasmids、IKKαsiRNA),阴性对照组(MASPIN-plasmids NC、IKKα-siRNA NC),荧光对照组(MASPIN-pEX-1、IKKα-FAM NC)和LPS对照组(control),利用脂质体法分别转染MASPIN质粒和IKKα小干扰RNA并检测转染效率;转染成功后,将实验分为三组:分别是实验组(MASPIN plasmids、IKKαsiRNA),LPS对照组(control),空白对照组(negative control),利用Real-time PCR和Western Blot、ELISA分别检测MASPIN过表达、IKKα沉默后LPS刺激的HOKs中MASPIN、IKKα及炎性细胞因子的mRNA和蛋白表达。结果:免疫组织化学实验显示MASPIN和IKKα主要定位于OLP组织上皮层的胞质中,另外,同健康对照组相比,OLP组中MASPIN低表达,而IKKα与炎性细胞因子(TNF-α,IL-6)高表达,且差异均具有统计学意义(P0.01)。CCK8实验显示5ug/ml和10ug/ml的LPS对HOKs无毒性作用,同时,ELISA实验表明10μg/ml LPS刺激的HOKs中TNF-α和IL-6的蛋白表达量最高,差异具有统计学意义(P0.05),因此,本实验最终选择10ug/ml的LPS作为刺激浓度;Real-time PCR实验表明MASPIN质粒和IKKαsiRNA均成功转染入HOKs中,且转染效率分别为57%和87%;此外,同LPS对照组相比,MASPIN过表达组中IKKα和炎性细胞因子TNF-α,IL-6低表达,差异具有统计学意义(P0.05),这表明MASPIN过表达抑制了LPS刺激的HOKs中IKKα及TNF-α,IL-6的表达;相反,同LPS对照组相比,IKKα沉默组中MASPIN表达升高,而TNF-α,IL-6表达下降,差异具有统计学意义(P0.05),这表明IKKα沉默促进了MASPIN的表达,抑制TNF-α和IL-6分泌。结论:本实验发现OLP组织中MASPIN低表达,而IKKα和炎性细胞因子TNF-α、IL-6高表达;过表达MASPIN或沉默IKKα可通过抑制炎性细胞因子TNF-α和IL-6的表达而缓解LPS引起的炎性反应,推测MASPIN及IKKα可能参与并影响了OLP的发生发展,提示MASPIN和IKKα可能为OLP的潜在治疗靶点。
【图文】：

过表达,效率,明场

１６入 MASPIN plasmids 6h 后 FAM-NC 组中暗场及明场荧光细胞数量；（b）Real-ti和 Western Blot（右）检测 MASPIN 过表达效率；（c）加入 IKKα siRNA6h 后 F及明场荧光细胞数量；（d）Real-time PCR（左）和 Western Blot（右）检测 IK效率；(* p < 0.05, ** p < 0.01 vs. Control 组)图 4 MASPIN 过表达和 IKKα 沉默效率检测 MASPIN过表达抑制了HOKs中IKKα和炎性细胞因子的表达MASPIN质粒转染成功后24h加入LPS，于培养箱中继续培养24h，收细胞总RNA进行Real-time PCR实验来检测相关基因的表达，实验结

炎性细胞因子,蛋白表达

eal-time PCR 检测 IKKα 沉默后 MASPIN、TNF-α 和 IL-6 的 mRNA 表达；（b）WesteKα 沉默后 IKKα 和 MASPIN 的蛋白表达；（c，，d）ELISA 检测 IKKα 沉默后 TNF-α（右）的蛋白表达 (# p < 0.05, ## p < 0.01 vs Negative Control 组；* p < 0.05, ** p < Control 组)图 6 IKKα 沉默促进 MASPIN 表达、抑制炎性细胞因子表达
【学位授予单位】：山西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R781.5

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