脱乙酰壳聚糖—三氟乙酸对变异链球菌抑菌特性的体外研究

发布时间：2020-05-19 14:24

【摘要】：目的:龋病是人类口腔的常见病、多发病,世界卫生组织已经把龋病列为人类重点防治的三大非传染性疾病之一。变异链球菌是口腔中的常驻菌之一,同时也是龋病的主要病原菌。壳聚糖(chitosan, CS)是甲壳素脱乙酰化的衍生物,是自然界中唯一的碱性多糖。独特的分子结构使其具有抑菌、抗肿瘤、增强免疫力、促进组织再生等功能。因其良好的生物相容性和可降解性,目前己被广泛的应用于医药领域。独特的理化性质使其便于制成膜、凝胶、微球等各种剂型,可满足多种施药途径的需要;特有的生物粘附性,有助于抵御唾液的冲刷和稀释。因而在龋病的预防和治疗方面,具有巨大的应用潜力。 三氟乙酸(trifluoroacetic acid, TFA)是一种含氟有机酸,它是许多有机化合物的良好溶剂,如与二硫化碳合用,可溶解蛋白质。它也是有机反应的优良溶剂,是重要的有机合成试剂,由它可以合成各种含氟化合物。关于壳聚糖的抑菌效果已有不少报导,本研究拟探索脱乙酰壳聚糖-三氟乙酸(CS-TFA)复合物对变异链球菌的抑菌效果以及对变异链球菌生长和产酸的影响。 方法:测定CS-TFA对变异链球菌的抑菌效果,将CS-TFA加入变异链球菌培养基中,测定其最小抑菌浓度和最小杀菌浓度,壳聚糖和人工唾液作为对照组。取96孔板,采用对倍稀释方法用TPY液体培养基配制实验溶液。加入浊度A540 =0.33的菌液40μl后,液体总体积为200μl。将96孔板于37℃厌氧环境中培养48h,取出肉眼观察各孔中细菌生长情况。需通过离心(3500r/min,离心8min),菌细胞用PBS缓冲液洗两次,PBS缓冲液重悬后,观察三组溶液对变异链球菌的抑菌作用。无细菌生长的最低浓度即该组溶液对变形链球菌的最小抑菌浓度(MIC)。 离心前,挑取肉眼观察可能无细菌生长的溶液,划线接种于TPY琼脂平板,37℃厌氧培养,分别观察培养后24h、48h平板上有无菌落生长,无细菌生长的最低浓度即为该药物对变异链球菌的最小杀菌浓度(MBC)。 用TPY液体培养基将药物配制成2倍终浓度的实验药液,加入TPY液体培养基0.5ml和浊度A540=0.33的菌液0.25ml后,液体总体积为l.5ml。各组均于37℃厌氧培养,在培养3h、22h、27h、32h、45h时,分批取出各试管,菌悬液混匀, 3500r/min离心8min,吸取上清液lml,平铺于玻璃平板上测定其pH值。 结果:CS-TFA和壳聚糖的最小抑菌浓度分别为1.0和1.5g/l,最小杀菌浓度为20g/l和30g/l,人工唾液组的细菌生长迅速,在接种后16h达到最大浊度,而CS-TFA组(5.0 g/l)和壳聚糖组(4.5g/l)则表现出延迟生长,在接种后32h后达到最大浊度,CS-TFA抑菌效果要优于壳聚糖。CS-TFA组和CS组的最终pH值分别为5.75和4.73,人工唾液组的最终pH值为3.52; pH值稳定后,人工唾液加入CS-TFA后的pH值为4.55,实验结束后,CS-TFA组和CS组细菌存活率分别为80%和87%,而人工唾液组的细菌存活率为93%。 结论:CS-TFA对变异链球菌的生长和产酸均有一定的抑制作用,是一种具有临床应用前景的防治龋病复合物。
【图文】：

对倍稀释方法用TPY液体培养基将药物配制成不同浓度的实验=0.33的菌液 40μl后，，液体总体积为 200μl。于37℃厌氧环境中观察各孔中细菌生长情况。离心(3500r/min，离心8min)，菌细胞用PBS缓冲液洗两次，PB察实验组对变异链球菌的抑菌作用。无细菌生长的最低浓度即菌的MIC。前，挑取肉眼观察可能无细菌生长的溶液，划线接种于TPY琼脂，分别观察培养后24h、48h平板上有无菌落生长，无细菌生长药物对变异链球菌的MBC。取菌液后的96孔板置多孔板高效分析仪上，测定各孔液体635n。将经离心、PBS洗菌和重悬的96孔板置多孔板高效分析仪上定各孔的吸光度值。△ A=A测定一A阴性对照测定的 △ A绘制折线图。结 果

9图 3. 两种药物对变异链球菌抑制作用的比较1为扫描电镜下观察正常条件下变异链球菌的形态，由图可见变异球菌。2为脱乙酰壳聚糖-三氟乙酸（CS-TFA）对变异链球菌的抑菌圈，由清晰可见。图3可见，当壳聚糖浓度<1.5g/l时，随着壳聚糖浓度的增加，对细渐增加，抑制作用曲线呈上升趋势，当壳聚糖浓度≥1.5g/l时，变受到明显抑制，抑制作用曲线平稳，曲线的拐点在壳聚糖浓度为1壳聚糖-三氟乙酸浓度<1g/l时，随着CS-TFA浓度的增加，对细菌的强，抑制作用曲线呈上升趋势，当壳聚糖-三氟乙酸浓度≥1g/l时，稳，变异链球菌的生长受到明显抑制，曲线的拐点在CS-TFA浓度为
【学位授予单位】：大连医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R781.1

【参考文献】

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本文编号：2671023