牙龈卟啉单胞菌对牙龈上皮细胞粘附和炎症介质的影响以及多酚对细胞炎症反应调节的体外研究

发布时间：2020-06-08 00:14

【摘要】： 目的慢性牙周炎是一种以牙周微生物为始动因子,宿主免疫防御反应参与的多因素的慢性破坏性炎症性疾病。在牙周微生物中,牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonasgingivalis,P.gingivalis)是证据充分的牙周可疑致病菌,该菌具有多种毒力因子,如菌毛、牙龈素等,可促进P.gingivalis粘附和侵入上皮细胞,导致上皮组织的直接破坏;同时,上皮细胞在P.gingivalis及其产物的刺激下,细胞内若干信号通路被激活,引起细胞的免疫炎症反应,促进了牙周炎症的发生发展。P.gingivalis及其产物与上皮细胞之间的相互作用一直是牙周病学研究领域的热点之一。本实验应用Western blot法检测P.gingivalis ATCC 33277及其fimA缺陷突变株对牙龈上皮细胞的焦点粘附成分——焦点粘附蛋白Paxillin和焦点粘附激酶(focal adhesion kinase,FAK)蛋白表达的影响,探讨菌毛的致病作用,进一步研究P.gingivalis对牙周组织的破坏机制,从而丰富和完善牙周病病因学理论;采用酶联免疫吸附试验和实时逆转录聚合酶链反应检测P.gingivalis膜泡诱导下牙龈上皮细胞前列腺素E_2(prostaglandin E_2,PGE_2)的蛋白分泌及环氧化酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2),白细胞介素(interleukin,IL)-6和-8及基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)-1和-3的mRNA表达水平,从而考察牙龈上皮细胞对P.gingivalis膜泡刺激的免疫炎症反应,建立细胞炎症反应模型,旨在揭示P.gingivalis的致病机理,并为阐述牙龈上皮细胞在局部免疫反应中的作用提供证据;同时,检测蛇麻子多酚(hop bract polyphenol,HBP),苹果多酚(apple condensedpolyphenol,ACT)和绿茶多酚(epigallocatechin gallate,EGCg)对P.gingivalis膜泡诱导的细胞炎症反应的作用,试图寻找一种新的牙周炎症抑制剂,为牙周炎的预防和治疗提供新的思路。材料与方法一、实验材料 1、菌株、细胞和主要试剂 P.gingivalis ATCC 33277野生株和fimA缺陷突变株(日本大阪大学齿学部中央实验室提供) 永生化人类牙龈上皮细胞(日本大阪大学大学院齿学部牙周病学科Murakami教授惠赠) 角化细胞特异性培养液(HuMedia KG2,Kurabo,Osaka,Japan) DMEM(Sigma Chemicals,St.Louis,MO) Paxillin和FAK单克隆抗体(Transduction Laboratories,Lexington,KY) ECL Plus Western blotting检测试剂盒(Amersham Biosciences,UK) PGE_2免疫检测试剂盒(RD Systems,Abingdon,UK) TRIzol(Invitrogen,Carlsbad,CA) 逆转录试剂盒(Invitrogen,Carlsbad,CA) SYBRGreen试剂(QIAGEN,Hilden,Germany) 2、主要仪器设备超低温冰箱(Sanyo,UltraLow,Japan) 厌氧培养箱(PLAS-LABS,USA) CO_2培养箱(Heraeus,Germany) 电泳仪以及Western blot全套专用设备(BIORAD,USA) 热循环仪LightCycler 2(Roche Molecular Biochemicals,Mannheim,Germany) HBP(Fundamental Research Laboratory,Asahi Breweries Ltd,Japan) ACT(Fundamental Research Laboratory,Asahi Breweries Ltd,Japan) EGCg(Ftmakoshi Co.,Tokyo,Japan) 二、实验方法 1、细菌培养:将P.gingivalis ATCC 33277野生株和fimA缺陷突变株培养于含有酵母浸出物和氯化血红素的胰酶大豆肉汤培养基(trypsinase soy broth,TSB)中厌氧培养达到对数期。 2、膜泡的分离提取:经离心和过滤去除P.gingivalis ATCC 33277培养液中的菌体,上清液进行超速离心(100,000×g,1h,4℃),以500μl磷酸缓冲液溶解沉淀,即获得牙龈卟啉单胞菌膜泡(vesicles)。用BCA蛋白检测试剂盒检测膜泡溶液的蛋白含量,调整浓度为1mg/ml,-80℃冻存备用。 3、细胞培养:永生化人类牙龈上皮细胞(immortalized human gingival epithelialcells,IHGE细胞)培养于角化细胞特异性培养液(HuMedia KG2)中,Hela细胞培养于DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium)中,加入10%胎牛血清(fetal calfserum,FCS),在饱和湿度的环境中(95%O_2,5%CO_2,37℃)培养。 4、多酚的预备:HBP,ACT和EGCg以二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)溶解,使DMSO在实验中的终浓度为0.05%(v/v)。 5、Western blot检测Paxillin和FAK的表达:IHGE细胞和Hela细胞以DMEM(含10%FCS)培养于6孔板中至亚融合。向培养液中加入P.gingivalis ATCC33277野生株及其fimA基因缺陷突变株,使感染复数(multiplicity of infection,MOI)分别为0,50,200,500。分别在感染后0,30,60,120min时以Triton-裂解缓冲液处理细胞,收集细胞裂解液。蛋白样品经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis,SDS-PAGE)后,电转印于聚偏氟乙烯(Polyvinylidene Fluoride,PVDF)膜上。先后与Paxillin或FAK一次抗体及辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)标记的二次抗体杂交后,显影成像。 6、酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测P.gingivalis膜泡诱导的PGE_2分泌:IHGE细胞以HuMedia KG2细胞培养液培养于96孔板中至亚融合。实验前将P.gingivalis膜泡以DMEM稀释,使膜泡终浓度为25μg/ml和50μg/ml。将细胞培养于含有或不含有膜泡的DMEM中,6h和24h后,以ELISA试剂盒检测上清液中PGE_2含量。 7、实时逆转录聚合酶链反应(real-time reverse transcription-polymerase chainreaction,real-time RT-PCR)定量检测P.gingivalis膜泡诱导的前炎症mRNA的表达水平:IHGE细胞以HuMedia KG2培养液培养于6孔板中至40%融合,继而以DMEM孵育24h至亚融合。向培养液中加入P.gingivalis膜泡并使其终浓度达到50μg/ml,分别在0,1,3,6,9,12和24h以TRIzol处理单层细胞,提取总RNA。使用热循环仪和SYBRGreen试剂将COX-2,IL-6,IL-8,MMP-1和MMP-3mRNA表达水平定量。 8、ELISA检测HBP,ACT和EGCg对PGE_2的影响:以DMEM稀释HBP,ACT和EGCg,使此三种多酚的终浓度为1,10,25μg/ml三个浓度梯度。将细胞培养于含有或不含有50μg/ml P.gingivalis膜泡及HBP,ACT和EGCg的DMEM中,24h后,以ELISA试剂盒检测上清液中PGE_2含量。 9、Real-time RT-PCR法检测HBP,ACT和EGCg对前炎症mRNA表达水平的影响:向培养液中加入P.gingivalis膜泡使其终浓度达到50μg/ml,同时加入EGCg,HBP和ACT使其终浓度为1,10,25μg/ml。6h后,以TRIzol处理单层细胞,提取总RNA。使用热循环仪和SYBRGreen试剂将COX-2,IL-6,IL-8,MMP-1和MMP-3 mRNA表达水平定量。三、统计学分析所有的数据以平均数±标准差(SD)来表示,使用非配对t-检验进行比较分析,P＜0.05时数据的差异具有显著性。结果 1、P.gingivalis对Paxillin和FAK的降解作用 P.gingivalis ATCC 33277野生株和fimA缺陷突变株能够使IHGE细胞和HeLa细胞的Paxillin和FAK发生降解,其fimA缺陷突变株对Paxillin和FAK的降解能力较野生株显著减弱。 2、P.gingivalis膜泡诱导的牙龈上皮细胞炎症反应 (1)以P.gingivalis膜泡(10,50μg/ml)刺激IHGE细胞,分别于6h和24h,ELISA检测PGE_2的分泌水平。结果表明,于24h P.gingivalis膜泡(10,50μg/ml)显著性浓度依赖性地促进牙龈上皮细胞PGE_2的分泌。 (2)以P.gingivalis膜泡(50μg/ml)刺激IHGE细胞,分别在0,1,3,6,9,12和24h以Real-time RT-PCR法检测IHGE细胞的COX-2,IL-6,IL-8,MMP-1和MMP-3mRNA的表达水平。P.gingivalis膜泡显著性促进牙龈上皮细胞COX-2,IL-6,IL-8,MMP-1和MMP-3 mRNA的表达水平。 3、HBP,ACT和EGCg对P.gingivalis膜泡诱导的牙龈上皮细胞炎症反应的作用 (1)HBP,ACT和EGCg对P.gingivalis膜泡诱导的PGE_2的影响:HBP在所有被测浓度(1,10,25μg/ml)均显著性抑制了IHGE细胞的PGE_2分泌,呈浓度依赖性;EGCg仅在10,25μg/ml具有抑制PGE_2分泌的作用;而ACT对PGE_2的分泌无抑制作用。 (2)HBP,ACT和EGCg对P.gingivalis膜泡诱导的COX-2,IL-6,IL-8,MMP-1和MMP-3 mRNA表达水平的影响:HBP在10,25μg/ml显著性抑制COX-2,IL-6,IL-8的mRNA表达水平,在25μg/ml显著性抑制MMP-1和MMP-3 mRNA表达;EGCg仅在10,25μg/ml能够显著性抑制COX-2的mRNA表达,对IL-6,IL-8,MMP-1和MMP-3的mRNA表达无抑制作用;而ACT则对上述被测mRNA的表达均无抑制作用。结论 1、P.gingivalis能够使牙龈上皮细胞的焦点粘附成分Paxillin和FAK发生降解,菌毛介导的粘附和侵入可能对焦点粘附成分的降解起着促进作用。IHGE细胞较Hela细胞对P.gingivalis的反应更灵敏,更适用于牙周致病菌的研究。2、P.gingivalis及其产物与牙龈上皮细胞之间的相互作用是该菌感染牙周组织的起始和关键,除了该菌的直接破坏作用外,P.gingivalis膜泡可显著性诱导牙龈上皮细胞的细胞炎症反应,促进前炎症介质的分泌和mRNA表达,过度的免疫炎症反应可能是牙周炎发生发展的主要原因。 3、HBP对P.gingivalis引起的牙龈上皮细胞炎症反应具有显著的抑制作用,具有成为牙周炎症抑制剂的潜能,为牙周炎的预防和治疗提供了新的思路。
【图文】：

缺陷,突变株,降解能力

CW乙W乙W乙P袱illin图1， westemblot法检测 pgingivalisATcC33277野生株和fimA缺陷突变株对IHGE细胞Paxillin蛋白表达水平的影响。A:MOI为200时，pgl’ngl’ valisATCC33277野生株及其filnA缺陷突变株均能够使IHGE细胞的Paxillin显著降解，在相同感染时间，filnA缺陷突变株对Paxillin的降解能力较野生株显著减弱。B:感染后60min， pgingivofisATCc33277野生株和fimA缺陷突变株对Paxiliin的降解程度随着MOI的增加而增大;Mol相同的情况下，fimA缺陷突变株对Paxillin的降解能力较野生株显著减弱。c:对照组(无感染 );w:p91从萝 valisATCc33277野生株;乙:pg动 lgivalisATCC 33277fimA缺陷突变株;MOI:感染复数;Paxiliin分子量 :68kDa。

突变株,缺陷,降解能力

里纷..一-一一IKO人MF图2， Westemblot法检测 pgingivalisATCC33277野生株和fin1A缺陷突变株对IHGE细胞FAK蛋白表达水平的影响。A:Mol为200时， pgingivalisATCC33277野生株及其fimA缺陷突变株均能够使IHGE细胞的队K发生降解，在相同感染时间，fimA缺陷突变株对Paxiliin的降解能力较野生株显著减弱。B:感染后60min，， pgingivalisATCC33277野生株和6mA缺陷突变株对FAK的降解程度随着MOI的增加而增大;MOI相同的情况下，五mA缺陷突变株对FAK的降解能力较野生株显著减弱。C:对照组(无感染 );w:pgingivalisATCC33277野生株;乙:尸 gingivalisATCC 33277fimA缺陷突变株;Mol:感染复数;FAK分子量 :125kDao
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：R781.4

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