LPS对人牙周韧带细胞核转录因子-κB表达及炎性细胞因子分泌的研究

发布时间：2020-06-08 07:45

【摘要】： 目的通过体外培养获得人牙周韧带细胞(human periodontal ligament cells,HPDLCs),并通过观察脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)对HPDLCs增殖及分泌肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、γ干扰素(interferon-γ,IFN-γ)、白细胞介素-β(interleukin-1β,IL-1β)以及白细胞介素-8(interleukin-8,IL-8)的影响,观察LPS作用HPDLCs后核转录因子-kB(nuelearfactor kappa B,NF-kB)的表达情况,探讨LPS在牙周炎发病过程中的作用,为寻找预防和药物治疗牙周炎的新途径提供理论依据。 方法收集12-28岁因正畸拔除的健康前磨牙60例,采用组织块直接贴壁培养法体外分离培养HPDLCs,并行人牙周韧带细胞来源鉴定。将HPDLCs分为两组,即实验组和对照组:分别置于含有不同浓度LPS(实验组:0.01μg/ml、0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml及100μg/ml;对照组0μg/ml)的培养基培养24h后,MTT法检测HPDLCs增殖情况。选用10μg/ml的LPS作用HPDLCs 24h后,分别检测LPS作用HPDLCs前后其碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)的活性。选用10μg/ml的LPS刺激HPDLCs,并采用酶联免疫吸附试验(enzymelinked immunosorbent assay,ELISA)分别检测LPS刺激前及刺激3h、6h、24h、48h后细胞上清液中TNF-α、IFN-γ)、IL-1β、IL-8的表达情况。选用10μg/ml的LPS刺激HPDLCs 24h,用免疫荧光法检测LPS刺激前后HPDLCs中NF-kB的表达情况。多样本均数比较采用单因素方差分析,两样本均数比较采用t检验。检验标准α=0.05,结果以P0.05为差异具有统计学意义。 结果 1.体外培养HPDLCs60例,成功15例,成功率为25%。经免疫组化染色显示所培养细胞抗角蛋白染色阴性,抗骨桥素(osteopontin,OPN)染色阳性,证明细胞非上皮来源,并具有成骨特性。 2.低于1μg/ml浓度的LPS可促进HPDLCs的增殖,其中促进作用最为明显的浓度为0.01μg/ml(P0.05),随着浓度的增加促进作用逐渐下降;LPS浓度达到10μg/ml和100μg/ml时对HPDLCs增殖则无影响(P0.05)。 3.LPS作用24h后HPDLCs的ALP活性明显下降(P0.01)。 4.LPS刺激HPDLCs 3h后即可检测到TNF-α、IFN-γ以及IL-1β分泌量均明显升高(P0.05),并随作用时间延长逐渐升高,到24h达到高峰;随后三种细胞因子分泌量均逐渐下降,至48h时IFN-γ和IL-1β仍维持一较高水平(P0.05),而TNF-α分泌量则恢复至刺激前水平(P0.05)。LPS刺激HPDLCs3h和6h检测IL-8的分泌受到明显抑制(P0.05),随后才出现时间依赖性增加,直至24h后IL-8分泌量才高于刺激前水平,到48h达到顶峰(P0.05)。 5.LPS作用前免疫荧光检测NF-kB主要表达于细胞浆中,胞浆内有较强的荧光显示,细胞核荧光较弱;LPS作用后NF-kB发生了明显的核转位,在细胞核内荧光明显加强,细胞浆内荧光减弱。 结论 1.组织块培养法培养HPDLCs简便且成功率较高,第4-8代细胞具有较高的增殖活性,适用于相关的体外实验研究。 2.LPS可直接影响HPDLCs的增殖、抑制其成骨特性,并可刺激HPDLCs引起炎性细胞因子的分泌,证明LPS是牙周炎症和牙槽骨吸收的重要毒力因子。 3.LPS可刺激HPDLCs分泌各种炎性细胞因子,并且具有一定的时效关系,不同炎性因子其时效关系不同。 4.LPS刺激可使HPDLCs发生明显的NF-kB核转位,证明NF-kB参与了LPS诱导的牙周炎症反应。
【图文】：

第4代HPoLCs(X400)

放射状或旋涡状的成纤维细胞集落单位，部分细胞相互接触(图1)。随着培养时间的延长细胞逐渐相互汇合，密度逐渐增加，一周后可见细胞基本长满皿底(图2)。消化传代后4h细胞即可贴壁，24h后贴壁细胞全部伸展变形。倒置显微镜下HPDLCs呈长梭形，具有2一3个胞浆突起;胞体丰满，胞浆均匀、透明;核圆形或卵圆，位于细胞中央，，核仁清晰，2一5个核仁(图3)。传代
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R78

【参考文献】

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本文编号：2702762