常见牙源性干细胞性能对比及脂多糖对牙周膜干细胞的影响及机制

发布时间：2020-06-11 11:25

【摘要】：研究背景与目的组织工程是近年来正在兴起的一门前沿学科,对于容易造成软硬组织缺损的疾病来说,组织工程技术能够为已缺损或丧失的组织重建新的有功能的结构,从而备受关注。种子细胞的选取对于组织工程来说至关重要,选择一种具有优越的自我更新和多向分化能力的干细胞,决定着“再生”这一过程的成败。近年来,多种口腔组织来源的成体干细胞的发现使口腔组织再生迈出了关键的一步。迄今为止,已有多种牙源性间充质干细胞被分离及鉴定,这些干细胞可来自牙髓、牙周膜、根尖乳头、脱落乳牙、发育中的牙囊、牙龈组织。在这众多的细胞之中,牙髓干细胞(dental pulp stem cells,DPSCs)、牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells,PDLSCs)和牙龈干细胞牙龈干细胞(gingival MSCs,GMSCs)是三种最容易获取的牙源性干细胞,且其组织来源能够一次性地从同一个体获得(例如需要切开牙龈拔除的阻生智齿),因此本实验的前部分致力于在体外详尽地比较同一供体来源的这三种牙源性干细胞不同传代次数下的性能,为它们各自性能的优化提供思路,为口腔组织工程种子细胞的选取提供策略。此外,在组织再生过程中,宿主局部微环境在很大程度上影响着组织再生的效果,鉴于骨组织工程的应用更加成熟广泛,针对上述三种牙源性干细胞中成骨能力最强的干细胞,进一步了解其在炎症微环境下成骨能力的变化及相应的机制也至关重要。细菌脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)是一种内毒素,作为Gram阴性菌外膜的主要成分,被普遍认为是口腔微环境中的一个有害因子。但特定浓度下的LPS对成体间充质干细胞成骨分化性能的影响尚无明确定论,有些认为抑制,而有些认为促进。因此本实验的后半部分重点在于探究细菌脂多糖对牙周膜干细胞成骨分化能力的影响及可能的作用机制。材料与方法1.利用酶解组织块法分离、培养原代DPSCs、PDLSCs与GMSCs;利用流式细胞术检测三种牙源性干细胞的间充质干细胞特异性表面标志物,利用成骨、成脂、成软骨诱导检验三种牙源性干细胞的多向分化潜能;进行三种间充质干细胞的传代、冻存、复苏,获得三种细胞的第四代(P4)和第11代(P11)的细胞。2.利用CCK-8技术,EdU核酸标记技术检测三种细胞不同传代次数(P4及P11)下的增殖能力,利用β-半乳糖苷酶染色技术检测三种细胞在P4及P1]的衰老情况,利用Annexin-V-APC染色技术检测三种细胞在P4及P11的凋亡,利用ALP染色技术、ALP活性检测技术、茜素红染色技术检测三种细胞在P4及P11的成骨分化能力,利用油红O染色技术检测三种细胞在P4及P11时的成脂分化能力;利用qRT-PCR技术检测干性相关mRNA(c-MYC,NANOG,KLF4,OCT4)的表达水平、成骨分化相关mRNA(ALP、RUNX2、Coll等)的表达水平;利用Western Blot技术检测细胞周期、细胞衰老、细胞凋亡、细胞成骨分化等相关蛋白及增殖成骨相关信号通路核心蛋白的表达。3.利用重组慢病毒技术敲低牙周膜干细胞中TAZ(transcriptional activator with a PDZ motif)的表达,探究TAZ在LPS所导致的PDLSCs成骨分化能力变化中的作用;利用Wnt/β-catenin信号通路抑制剂DKK-1探究经典Wnt信号通路在此过程中的作用。实验结果1.成功分离培养出了同一供体来源的原代DPSCs、PDLSCs与GMSCs,并稳定传代至P4及P11;三种牙源性干细胞均具有自我更新能力,表达间充质干细胞特异性表面标记物,并可以成骨、成脂、成软骨(至少三系)分化,满足间充质干细胞的标准。2.将不同代数的三种细胞进行增殖、衰老、干性维持、凋亡、成骨向分化、成脂向分化等性能的综合对比,结果显示:相较于其他两种细胞,GMSCs表现出优异的增殖能力,而PDLSCs表现出优异的成骨向和成脂向分化能力,DPSCs在这增殖及分化这两个方面表现居中。此外,GMSCs受长期体外传代的影响最小,而PDLSCs则最易受体外传代次数的影响而最容易衰老。三种细胞的生物学性能在长期体外培养后都受到一定程度的负面影响。3.大肠杆菌来源的LPS(0.5 μg/mL)不影响PDLSCs的增殖但可促进其成骨分化,其促成骨的过程与TAZ的上调密切相关,而TAZ的上调又受到经典Wnt信号通路的调控。实验结论及意义三种牙源性干细胞在体外均具有自我更新和多项分化潜能,其中PDLSCs更适合于骨组织再生,但其应用需控制在一定代数之内;对于GMSCs,在应用过程中想办法提高其分化能力至关重要。在微量LPS的刺激下,PDLSCs的成骨能力不降反升,而这种成骨能力的增强受TAZ及经典Wnt信号通路的调控。
【图文】：

传代培养,原代培养

染液没过细胞，染色５－３０邋ｍｉｎ。④清洗。ＰＢＳ溶液清洗细微镜下观察矿化结节及脂滴含量。⑥扫描记录。将染色后的留记录。逡逑化：成软骨分化采取小球培养方法，将细胞置于成软骨诱管中悬浮培养，４周后对成软骨分化诱导产生的小球组织进行阿新兰染色，之后于显微镜下观察。逡逑果逡逑ｓ、ＤＰＳＣｓ、ＧＭＳＣｓ的原代培养及传代培养逡逑１０－１４天的生长，于显微镜下观察可见三种细胞的原代细胞均，形状为长梭形（图１－１）。在经历较少次数的体外传代后，呈现光滑一致的成纤维细胞样形态，细胞较为密集时呈旋涡历较多次数的体外传代后，，ＰＤＬＳＣｓ的Ｐ１１细胞形态稍有改大，表现出刺状凸起（图卜１）。逡逑Ｐ0逦Ｐ４逦Ｐ１１逡逑

表面标志,流式,干细胞

２．２ＰＤＬＳＣｓ、邋ＤＰＳＣｓ、邋ＧＭＳＣｓ表明标志物的检测逡逑利用流式细胞仪检测三种牙源性干细胞（Ｐ３）的表面标志物。结果如图所示逡逑（图１－２），三种牙源性干细胞均阳性表达间充质干细胞特异性表面标志物，阴性逡逑表达造血及上皮细胞特异性表面标志物。具体表达量为：①ＰＤＬＳＣｓ：逡逑ＣＤ９０＝９９＿７±０．２２％、ＣＤ４４＝９９．７±０．１７％、ＣＤ１０５＝９９．６±０．３２％、ＣＤ７３＝９９．８士邋０．１１％、逡逑ＣＤ３４＋ＣＤ１１６＋ＣＤ１９＋ＣＤ４５＋ＨＬＡ－ＤＲ＝２．０３士０．４３％邋（图邋１－２邋Ａ）。②ＤＰＳＣｓ：逡逑ＣＤ９０＝９９．５±０．３６％、ＣＤ４４＝９９．７±０．２５％、ＣＤ１０５＝９９．８±０．１５％、ＣＤ７３＝９９．７±０．２４％、逡逑ＣＤ３４＋ＣＤ１１６＋ＣＤ１９＋ＣＤ４５＋ＨＬＡ－ＤＲ二邋１．３７士０．５６％邋（图邋１－２邋Ｂ）。③ＧＭＳＣｓ：逡逑ＣＤ９０＝９９．６土邋０．３２％、ＣＤ４４＝９９．９±０．１３％、ＣＤ邋１０５二９９．６±０．２９％、ＣＤ７３＝９９．８±０．２３％、逡逑ＣＤ３４＋ＣＤ１１６＋ＣＤ１９＋ＣＤ４５＋ＨＬＡ－ＤＲ＝２．７６士０．３８％邋（图邋１－２邋Ｃ）。此外邋ＳＴＲＯ－１邋在逡逑ＰＤＬＳＣｓ、ＤＰＳＣｓ、ＧＭＳＣｓ邋中的表达量分别为邋３７．７±０．１７％、２６．２±０．１４％、２１邋±０．１１邋％。逡逑Ａ邋逦邋逦邋逦．逦．逡逑＾，邋Ｉ邋．逦逦逦Ｊ邋Ａ邋＇ｃ0３？ｃ0１ｉｓ？＇逦ｈ逡逑0逦ＣＤＳＯ，丨逦，逦ｎ０５逦，逦咖＊”，逦，邋ＣＯ＾ＭＳ．逦ｉ逡逑＾邋ＪＪ邋＼一邋ｌ邋＼Ｊ＼邋—邋Ｊ．邋Ｊ邋ａ＿＾邋ｋ二＆：逡逑■
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R78

【相似文献】