大鼠正畸牙移动过程中Notch1信号通路参与牙槽骨吸收改建的初步研究

发布时间：2020-06-18 09:10

【摘要】：随着生活水平的提高和口腔健康知识的普及,大众越来越重视面部美观及口腔健康,要求正畸治疗以改善面部美观和口腔功能的患者也越来越多。但不少患者往往对长达2-3年的矫治周期望而却步,进而选择放弃正畸治疗或者选择其他治疗手段。如何寻找到高效又安全的加速正畸治疗过程中牙齿移动的方法是近年来正畸研究的热点和难点之一,而要解决这个难点,重点在于明确正畸牙移动(orthodontic tooth movement,OTM)过程中调控牙周组织改建和重塑的生物学机制。自正畸这门学科诞生以来,国内外的学者已经做了很多有关OTM过程中牙周组织改建和重塑机制的研究,并且发现在牙移动过程中,有众多因子参与其中,包括Wnt/β-catenin信号、P13K/AKt/m TOR信号、RANK-RANKL-OPG及Caspase-3信号等共同参与了牙周组织的改建过程。Wnt/β-catenin信号主要参与成骨细胞对正畸机械应力的反应过程,Wnt配体如Wnt3a和Wnt10b可通过诱导碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性和成骨细胞生成来调节骨量和矿化;P13K/AKt/m TOR信号则参与OTM期间成纤维细胞、成骨细胞等牙周膜细胞蛋白的合成与转录过程,为牙周组织改建做准备;RANK-RANKL-OPG三者相互作用在OTM期间抑制破骨细胞生成和骨吸收,Caspase-3信号则参与OTM期间的细胞凋亡过程。近年来越来越多的研究发现Notch信号通路在细胞与细胞间信号传递的过程中起着关键作用,尤其是在骨代谢过程中,Notch信号具有调节成骨细胞和破骨细胞谱系细胞分化和功能的潜能,并在骨骼发育、软骨形成等过程中起关键作用。成骨细胞和骨细胞中Notch1信号的激活诱导骨保护素(osteoprotegerin,OPG)生成增加并抑制骨吸收。Notch1通过直接和间接机制抑制破骨细胞生成,同时诱导OPG的生成增加。骨髓细胞培养物中Notch受体的Rbpjκ失活导致破骨细胞生成增强,表明Rbpjκ是破骨细胞生成的抑制剂,Notch1在破骨细胞分化中的作用是由经典机制介导的。而OTM正是正畸机械负荷介导下的牙周组织改建过程,骨改建是其中的重点,包括骨吸收改建和骨形成改建两个部分。有关Notch信号传导在参与骨免疫调节的骨丢失的细胞发育中的作用已有许多研究。然而,关于Notch1信号传导是否参与OTM期间正畸力诱导的牙槽骨吸收改建过程以及其作用机理尚不明确。本实验通过建立大鼠OTM模型及使用HE、TRAP及免疫组化染色技术,初步探讨Notch1信号通路是否参与OTM期间的牙槽骨组织吸收改建过程,以及使用Notch1信号通路抑制剂DAPT后对OTM期间的牙槽骨吸收改建过程进行初步研究。目的:通过检测Notch1信号通路相关分子(Notch1和Jagged1)在大鼠OTM期间的表达情况,以及使用Notch1信号通路抑制剂DAPT后对OTM过程中的牙槽骨组织吸收改建过程进行初步研究,探讨Notch1信号通路参与OTM过程的作用机理。方法:本实验纳入60只健康、成年、雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠,随机分成A、B两组:每组30只,每组又随机分成6个小组:0天组,1天组,4天组,7天组,10天组和14天组,每组5只。A组大鼠上颌左侧加力建立OTM模型,作为加力组;右侧不加力,作为不加力组;B组大鼠上颌左侧加力建立OTM模型,右侧不加力,且同时双侧第一磨牙粘膜转折处均注射0.6ml/kg DAPT溶液,自加力开始(0天),每两天注射一次:即左侧为加力+DAPT组,右侧为不加力+DAPT组。在相应时间点处死大鼠后,取下双侧包括上颌第一、第二磨牙及周围牙槽骨在内的组织块,测量第一、第二磨牙间的距离来评估OTM距离,采用HE染色观察OTM过程中牙周组织形态学变化、TRAP染色观察破骨细胞变化以及通过免疫组化染色观察牙移动过程中表达Notch1、Jagged1、OPG、RANK和RANKL的情况,并通过Image-Plus Pro 6.0软件测量免疫组化染色切片的平均光密度(mean optical density,MOD)值。所有数据使用SPSS 20.0软件进行分析。结果:1.OTM距离:在加力组和加力+DAPT组这两组中,从加力第1天起,OTM距离随加力时间增加而不断增大。除0天外,加力组与不加力组及加力+DAPT组与不加力+DAPT组比较,其差异均具有统计学意义(P0.05)。在第10天和第14天,加力组OTM距离明显小于加力+DAPT组(P0.05)。2 HE染色:在不加力组、不加力+DAPT组这两组中,大鼠磨牙牙根和牙槽骨表面较光滑,牙周膜韧带(periodontal ligament,PDL)宽度基本没有变化。从第4天开始,在加力组、加力+DAPT组这两组中观察到压力侧PDL宽度相对于张力侧PDL宽度变窄,随加力时间增加,这两组压力侧的PDL宽度比不加力组、不加力+DAPT组这两组压力侧的PDL宽度窄。在压力侧观察到破骨细胞和骨吸收凹坑,而在张力侧观察到成骨细胞和骨形成。3.TRAP染色:在不加力组、不加力+DAPT组这两组中,牙槽骨表面未观察到明显的TRAP阳性多核破骨细胞再吸收空洞。在加力组、加力+DAPT组这两组中,在第4天观察到压力侧牙槽骨表面出现明显TRAP阳性多核破骨细胞再吸收空腔。在第4、7、10和14天,加力组、加力+DAPT组这两组的TRAP阳性细胞数均明显多于不加力组、不加力+DAPT组这两组(P0.05)。在第10和14天,加力+DAPT组的TRAP阳性细胞数明显多于加力组(P0.05)。4.免疫组化染色:OTM模型建立后,随时间增加,加力组压力侧牙周膜Notch1、Jagged1、RANKL和RANK的阳性表达量逐渐上升,OPG的表达量则逐渐降低;不加力组压力侧牙周膜Notch1、Jagged1、RANKL、RANK和OPG的阳性表达量未见明显变化;加力+DAPT组压力侧牙周膜Notch1和OPG的表达量逐渐降低,Jagged1的表达量在第4和14天略有增加,RANKL和RANK的表达量逐渐上升;不加力+DAPT组压力侧牙周膜Notch1的表达水平逐渐降低,Jagged1、RANKL、RANK和OPG的表达量则未见明显变化。除0天外的其他时间点,加力组在压力侧牙周膜的Notch1、Jagged1、RANKL和RANK表达显著高于不加力组(P0.05),除0和1天,加力组OPG的表达显著低于不加力组(P0.05)。除0天外Notch1在加力+DAPT组的表达均显著低于加力组(P0.05),加力+DAPT组在第1、7、10和14天Jagged1的表达量均显著低于加力组(P0.05),加力+DAPT组RANKL的表达量在第4、7和10天均明显高于加力组(P0.05),加力+DAPT组OPG的表达水平在第4、7和10天均明显低于加力组(P0.05),除0和14天外,加力+DAPT组、加力组这两组的RANK表达水平差异有统计学意义(P0.05)。除0和1天外加力+DAPT组Notch1和RANK的表达水平均显著高于不加力+DAPT组,OPG的表达量明显低于不加力+DAPT组;除0天外加力+DAPT组RANKL的表达量均明显高于不加力+DAPT组(P0.05)。结论:Notch1信号通路相关蛋白Notch1、Jagged1以及OPG、RANK、RANKL的表达与在大鼠施加正畸力后的牙周骨组织吸收改建有关,这些观察结果表明Notch1信号通路可能在OTM期间的牙槽骨吸收改建过程中发挥作用。
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R783.5
【图文】：

柱形图,柱形图,统计学意义

TRAP 染色结果以破骨细胞胞浆呈酒红色为阳性信号，免疫组化染色结果以棕黄色颗粒为阳性信号。通过 Image-Plus Pro 6.0 软件测量其平均光密度（MOD）值，各组数据采用 SPSS 20.0 统计软件进行独立样本 t 检验。P＜0.05 有统计学意义。2 实验结果2.1 OTM 距离在加力组和加力+DAPT 组这两组中，从加力第 1 天起，OTM 距离随时间增加而不断增大。加力组与不加力组及加力+DAPT 组与不加力+DAPT 组比较，其差异具有统计学意义(P＜0.05)。在第 10 天和第 14 天，加力组 OTM 距离明显小于加力+DAPT 组(P＜0.05)。各组 OTM 距离见图 1。

宽度,纤维,学位论文,骨形成

重庆医科大学硕士研究生学位论文2.2 HE 染色各组 HE 染色结果见图 2。在不加力组、不加力+DAPT 组这两组中，大鼠磨牙 PDL 标本由相对致密的纤维和从根表面向牙槽骨延伸的成纤维细胞组成，牙根表面光滑，PDL 宽度没有变化。在加力组、加力+DAPT 组这两组中，观察到带有压缩毛细血管的 PDL 纤维排列紊乱且粗糙，并且在整个实验期间观察到拉伸的纤维。从第 4 天观察到加力组、加力+DAPT 组这两组中，压力侧 PDL 宽度相对于张力侧 PDL 宽度变窄，随加力时间增加，比不加力组、不加力+DAPT 组这两组的PDL 宽度变窄，且张力侧 PDL 宽度则增大。此外，在压力侧观察到破骨细胞和骨吸收凹坑，而在张力侧观察到成骨细胞和骨形成（图 3）。

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