釉原蛋白对MDPC-23细胞分化影响的实验研究

发布时间：2020-07-02 05:05

【摘要】：成牙本质细胞分化是牙髓组织自身损伤修复过程中的关键环节,也是牙胚发育的重要阶段,这一过程受多种因子的调控,寻找诱导成牙本质细胞分化的因子并阐明其诱导机制,一直是牙髓生物学的研究热点,也是认识牙髓损伤修复过程、形成治疗新靶点的关键。目前已发现多种细胞外基质分子及其受体、生长因子及受体、同源异形盒基因、原癌基因及转录因子、维甲酸及其受体、细胞粘附分子等参与成牙本质细胞的分化,其中,生长因子及其受体参与细胞调控、分化的研究始终是生命科学研究的热点。釉原蛋白(Amelogenin,AMG)是成釉细胞分泌的一组同源性的低分子量(20～30KD)的疏水蛋白,富含脯氨酸、谷氨酰胺和组胺酸,是釉基质蛋白的主要成分,约占90%,它在牙齿发育的各个阶段均有表达,以往对于釉原蛋白的研究主要集中于其在牙胚发育中的表达、对釉质发育形成的作用及其在牙周组织再生中的作用。2005年Tompkins等报道纯化的大鼠釉原蛋白可促进体外培养的小鼠牙胚中的成牙本质细胞的成熟,这提示釉原蛋白可能能够促进成牙本质细胞的分化成熟。本研究旨在观察小鼠釉原蛋白对体外培养的小鼠成牙本质细胞系MDPC-23分化的影响及其机制,研究釉原蛋白在成牙本质细胞分化过程中,对细胞存活,增殖和分化的影响,进一步研究其对MAPKs各通路蛋白磷酸化的影响,并应用MAPKs抑制剂和釉原蛋白联合作用,特异性阻断各MAPKs通路,观察釉原蛋白诱导成牙本质细胞分化的影响。为研究牙齿损伤修复过程中釉原蛋白参与成牙本质细胞分化过程的分子机制提供理论依据。研究内容和结果如下: 1.首先我们从MDPC-23细胞克隆到了小鼠的釉原蛋白基因,全长591bp,Genbank登录号为NM 009666,同时设计了干涉釉原蛋白的序列,在此基础上,构建了能高效过表达釉原蛋白和干涉釉原蛋白的重组腺病毒(Ad-AMG、Ad-shAMG)及对照腺病毒Ad-EGFP载体,进行病毒扩增和滴度测定,并感染MDPC-23细胞检测其表达及干涉效果,结果表明:构建的腺病毒载体能够正确地表达釉原蛋白或干涉其表达。 2.腺病毒感染MDPC-23细胞后光镜观察表明,过表达釉原蛋白导致MDPC-23细胞形成较长的突起,胞体相对缩小,表明细胞分裂活动变得旺盛,干涉釉原蛋白对MDPC-23细胞形态没有明显影响,通过MTT实验和流式细胞术检测发现过表达釉原蛋白抑制了MDPC-23细胞的生长速度,而干涉釉原蛋白则促进了MDPC-23细胞的增殖,流式细胞术结果表明过表达釉原蛋白导致MDPC-23细胞的G1期细胞比例升高,S期比例下降,而干涉釉原蛋白导致MDPC-23细胞的G1期比例降低,S期升高。碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase ,ALP)是成牙本质细胞分化的一个重要指标,因此,检测ALP活性的变化可以反应细胞的分化状态,通过ALP活性和矿化结节形成检测发现,过表达釉原蛋白后,MDPC-23细胞的ALP活性显著增高,矿化能力增强。RT-PCR结果表明,过表达釉原蛋白后,成牙本质细胞分化标志物DMP-1和DSPP的表达升高。相反,干涉釉原蛋白导致MDPC-23细胞的ALP活性降低,矿化能力减弱,DMP-1和DSPP的表达下降,Western结果表明,釉原蛋白促进MDPC-23细胞分化主要是通过ERK1/2 and p38通路起作用的。 3.为研究釉原蛋白诱导MDPC-23细胞分化的分子机制,我们采用了基因表达谱芯片筛选MDPC-23细胞分化的差异基因,如果实验组较对照组荧光染料的cy5/cy3比值在2.0以上,就判断为上调基因;如果实验组较对照组荧光染料的cy5/cy3比值在0.5以下,就判断为下调基因,依此标准共获得上调与下调的基因数目分别为1140和487。其中,有些变化的基因如骨形态发生蛋白7(bone morphogenetic protein7, BMP-7)、神经细胞粘附分子(Neural cell adhesion molecules, NCAMs)、细胞周期依赖蛋白激酶2(cyclin-dependent kinase 2, Cdk2)等都可能与釉原蛋白诱导的MDPC-23细胞分化相关,下一步拟用定量PCR的方法验证差异基因的变化情况,并进行相应的功能学实验,综上所述,我们的结果提示釉原蛋白在体外能够促进成牙本质细胞系MDPC-23的分化成熟,其机制有待于进一步研究。研究结论: 1.克隆到了小鼠的釉原蛋白基因,全长591bp,构建了能高效过表达釉原蛋白和干涉釉原蛋白的重组腺病毒(Ad-AMG、Ad-shAMG)及对照腺病毒Ad-EGFP载体,构建的腺病毒载体能够正确地表达釉原蛋白或干涉其表达。 2.过表达釉原蛋白导致MDPC-23细胞形成较长的突起,胞体相对缩小,表明细胞分裂活动变得旺盛,干涉釉原蛋白对MDPC-23细胞形态没有明显影响。过表达釉原蛋白抑制了MDPC-23细胞的生长速度,而干涉釉原蛋白则促进了MDPC-23细胞的增殖。过表达釉原蛋白导致MDPC-23细胞的G1期细胞比例升高,S期比例下降,而干涉釉原蛋白导致MDPC-23细胞的G1期比例降低,S期升高。过表达釉原蛋白后,MDPC-23细胞的ALP活性显著增高,矿化能力增强,成牙本质细胞分化标志物DMP-1和DSPP的表达升高,干涉釉原蛋白后结果相反,釉原蛋白可使ERK1/2和p38的磷酸化增强,对JNK的磷酸化没有影响,采用通路抑制剂U0126和SB203580可显著抑制ERK1/2和p38的磷酸化,同时可阻断釉原蛋白诱导的MDPC-23细胞分化。 3.采用基因表达谱芯片筛选MDPC-23细胞分化的差异基因,共获得上调与下调的基因数目分别为1140和487,其中,有些变化的基因如BMP-7、NCAMs、Cdk2等都可能与釉原蛋白诱导的MDPC-23细胞分化相关,下一步拟用定量PCR的方法验证差异基因的变化情况,并进行相应的功能学实验。
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R780.2
【图文】：

釉原蛋白,小鼠,北图,测序

图 1. 小鼠釉原蛋白基因的克隆T-AMG 载体的酶切鉴定和测序 PCR 产物，与 pMD18-T 载体进行连接，连接后电泳结果来看(图 2)，8 个克隆中，除第 5 个克隆有插入片断，选取酶切正确克隆进行测序，送北图 3)：

载体,酶切鉴定,片断,釉原蛋白

图 1. 小鼠釉原蛋白基因的克隆2. pMD18-T-AMG 载体的酶切鉴定和测序胶回收上述 PCR 产物，与 pMD18-T 载体进行连接，连接后进行 Bgl II 和切鉴定，从电泳结果来看(图 2)，8 个克隆中，除第 5 个克隆中没有插入片断7 个克隆均有插入片断，选取酶切正确克隆进行测序，送北京奥科公司进行结果如下(图 3)：

【参考文献】