MiR-127-5p-mimic和MiR-99a-inhibitor协同促进脂肪干细胞成软骨分化的相关研究

发布时间：2020-07-04 16:36

【摘要】：目的:1.分离培养棕色脂肪干细胞(Brown Adipose-derived mesenchymal stem cells BADSCs)和白色脂肪干细胞(White Adipose-derived mesenchymal stem cells WADSCs),并对两种细胞进行鉴定及生长动力研究。2.比较BADSCs和WADSCs体外成脂、成骨及成软骨能力,为组织工程种子细胞的选择提供理论依据。3.分别研究不同miRNA在ADSCs成软骨分化中的作用,以及不同miRNA在ADSCs成软骨分化中的协同作用,并试图探究其作用机制。方法:1.分离SD大鼠棕色及白色脂肪组织,得到BADSCs和WADSCs。倒置显微镜观察两种细胞的形态、细胞计数检测增殖能力、流式仪鉴定细胞表面抗原标记物。2.将BADSCs和WADSCs进行成脂、成骨和成软骨诱导。两种细胞成脂后进行油红-O染色,成骨后进行碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase ALP)活性检测及茜素红染色,成软骨后进行阿辛蓝染色。qRT-PCR进一步检测两种细胞成脂、成骨、成软骨相关基因的表达水平。3.通过qRT-PCR检测ADSCs软骨向分化过程中,miR-99a和miR-127-5p时间相关的表达趋势。随后将miR-99a-inhibitor和miR-127-5p-mimic通过lipofectamine2000递送至ADSCs,递送miR-99a-inhibitor的ADSCs指定为M组,递送miR-127-5p-mimic的ADSCs指定为N组,递送miR-99a-inhibitor和miR-127-5p-mimic的ADSCs指定为M+N组,没有进行处理的ADSCs充当阴性对照(NC组)。24小时后通过qRT-PCR检测ADSCs内miR-99a和miR-127-5p的含量,并通过MTT法检测四组细胞的增殖能力。4.四组ADSCs进行成软骨诱导,qRT-PCR检测软骨标志基因II型胶原蛋白(Type II collagen-A1 COL2A1)和聚集蛋白多糖(Aggrecan ACAN)mRNA的表达水平,Western Blot检测COL2A1和ACAN蛋白质的表达水平。结果:1.分离培养BADSCs和WADSCs,细胞贴壁后,倒置显微镜观察,二者形态类似,WADSCs胞体较BADSCs大;流式仪鉴定二者表面抗原标记物,均符合间充质干细胞的特征;细胞计数检测增殖能力表明WADSCs强于BADSCs。2.BADSCs和WADSCs都具有成脂分化能力。与BADSCs相比,WADSCs中脂滴形成相对较快且数量较多,相同时间点成脂标志基因PPAR、C/EBPB表达也相对较高;BADSCs和WADSCs均可成骨向分化。成骨诱导后相同时间点BADSCs的ALP活性较大,且5周时茜素红染色面积大于WADSCs。Runx2、OCN基因的表达也相对较高;BADSCs和WADSCs都具有成软骨分化能力。两种细胞切片的阿辛蓝染色和COL2A1、ACAN基因的表达量并无明显区别。3.MiR-99a-inhibitor和miR-127-5p-mimic通过lipofectamine2000递送至ADSCs,24小时后qRT-PCR检测到miR-99a的量低于NC组和miR-127-5p的量高于NC组;通过MTT实验测得四组ADSCs的增殖能力无明显差异。4.四组细胞用成软骨培养基进行诱导后,检测到M组和N组COL2A1、ACAN基因和蛋白水平的表达量高于NC组,M+N组COL2A1、ACAN基因和蛋白水平的表达量高于M组和N组。结论:1.本实验方法可较为快速的提取BADSCs和WADSCs并进行纯化。提取的BADSC和WADSCs都具有较强的增殖能力,可扩增为大量细胞,用于实验研究。2.BADSCs和WADSCs均具有成脂分化能力,但WADSCs成脂分化能力较强;BADSCs和WADSCs均具有成骨分化能力,但BADSCs成骨分化能力较强;BADSCs和WADSCs均具有成软骨分化能力,且二者成软骨分化能力无明显差异。3.MiR-99a和miR-127-5p在ADSCs的软骨分化中均可起到一定的调节作用,miR-99a在ADSCs的软骨分化中可起到抑制即负调节作用,miR-127-5p在ADSCs的软骨分化中可起到促进即正调节作用。MiR-99a-inhibitor可削弱miR-99a的负调节作用与正调节因子miR-127-5p协同促进ADSCs的软骨分化。
【学位授予单位】：山西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R78
【图文】：

（3） 在超净台内分离肩胛骨下和腹股沟脂肪组织（图 1-1）。将获取的脂肪组织浸泡在预冷的 PBS 里；（4） 去除血管和筋膜组织，PBS 冲洗 3-4 次；（5） 分离成体积大小为 1mm3的组织小块；（6） 将剪碎的脂肪组织小块移入含有玻璃球、磁力搅拌器转子、酶消化液（由体积比为 4：4：1：1 的 HG—DMEM、0.25%EDTA 一胰酶消化液、Dispase、Ⅳ胶原酶配制）的玻璃瓶；（7） 磁力搅拌器低转速下，孵箱中旋转消化 30-40min 左右；终止消化后，过滤悬液；（8） 以 1000rpm，5min 离心滤液，收集细胞，再加入 α- MEM（含 10% FBS）重悬，计数；（9） 接种，孵箱中常规培养；（10） 24h 后换液，以后隔 2 天换 1 次培养基，细胞长满 80%左右，消化传代培养。

（1） 从第 1 代开始，将 ADSCs 消化，重悬，计数；（2） 接种于 6 孔板，密度为 2.5×105个/孔。培养箱中培养 3d 后，第 2 代细胞胰酶消化后使用细胞计数板计数，每个样本取 3 个孔，计算均值；（3） 计数并离心后重悬细胞，以相同密度再次接种于 6 孔板为 P3 代，相同方法计数并记录；（4） P4～P9 代细胞利用上述方法依次进行计数并记录。1.3.6 统计学处理采用 SPSS18.0 软件分析数据，结果用“均数±标准差”的形式表达数据；进行单因素方差分析，或 t 检验。以双侧 P<0.05 为差异有统计学意义。2 结 果2.1 BADSCs 和 WADSCs 的形态学观察

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本文编号：2741319