miRNA-1-3p及LAMP2、LC3在成釉细胞瘤中的表达及意义

发布时间：2020-07-07 06:37

【摘要】：目的:成釉细胞瘤(ameloblastoma,AB)是常见的牙源性上皮源性肿瘤,具有局部侵袭性生长的生物学特性,且细胞增殖活跃,术后易复发,有恶变可能,甚至可发生转移,严重影响患者生存质量。细胞自噬是真核细胞处理自身产生的衰老、损伤或变性的蛋白及细胞器等生物大分子的一种现象,能使这些来源于细胞自身的成分在溶酶体内降解或再利用,为细胞提供能量,以帮助其度过生存危机,可起到阻止细胞衰老和死亡的作用,在肿瘤的发生发展中发挥一定作用。溶酶体在自噬过程中发挥重要作用。溶酶体相关膜蛋白2(lysosomal associated membrane protein 2,LAMP2)编码的蛋白是膜糖蛋白家族的成员、溶酶体膜蛋白的主要成分,其具有保护溶酶体膜免受酸性水解酶水解的功能,在细胞自噬中也行使一定功能。B细胞淋巴瘤蛋白质2-相互作用蛋白质1(B-cell lymphoma-2-interacting protein-1,Beclin1)编码调节自噬的关键蛋白,编码的蛋白质是磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)复合物的组分,其介导自噬过程中囊泡的运输,是细胞自噬的启动基因。在自噬体形成过程中,微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)分子由LC3-Ⅰ转化为LC3-Ⅱ,LC3-Ⅱ可与新形成的自噬体膜结合,直至自噬体与溶酶体融合,因此LC3-Ⅱ常被作为细胞内自噬的标记物。检测AB中LAMP2、Beclin1及LC3的表达水平可反映肿瘤自噬水平。目前,微小RNA(microRNA,miRNA)在转录后对基因表达的调控已受到广泛关注,许多研究已证明miRNA在自噬发生的不同阶段可发挥调控作用。利用芯片分析及生物信息学预测方法,筛选出AB组织中差异表达的miRNA-1-3p,作为LAMP2的可能调控分子,进一步验证其表达与LAMP2表达的相关性,从非编码RNA调控的角度,为AB的诊断和治疗提供新的方向。研究方法:(1)应用免疫组织化学染色实验方法,在104例AB组织蜡块和20例瘤旁正常口腔黏膜(NOM)组织蜡块中检测Beclin1、LC3及LAMP2的表达水平,应用Image J软件对结果进行定量。(2)应用蛋白质免疫印迹(Western Blot,WB)方法在新鲜AB及NOM组织中检测Beclin1、LC3及LAMP2的表达,以反映AB的自噬水平。(3)结合课题组前期对AB及NOM中Human miRNA表达谱芯片检测的结果,筛选与AB相关的差异性表达的miRNA,在下调的miRNA中通过生物信息学分析,选择miRNA-1-3p作为研究对象。(4)采用实时荧光定量PCR(quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)检测LAMP2及miRNA-1-3p在12对AB及NOM组织、人永生化成釉细胞瘤细胞AM-1及人永生化表皮细胞Hacat中的表达。(5)应用Spearman相关分析研究AB组织中miRNA-1-3p与LAMP2表达水平的相关性。结果:(1)免疫组织化学染色结果显示,Beclin1定位于AB上皮细胞的细胞质及细胞核,其在AB中表达的阳性率及定量结果均低于NOM(P0.05),在性别、年龄、发病部位、病理分型及是否复发方面差异无统计学意义(P0.05);LC3定位于AB上皮细胞的细胞质,其在AB中表达的阳性率及定量检测结果均高于NOM(P0.05),在发生于下颌骨的AB中LC3表达的阳性率显著高于发生于上颌骨及牙龈者(P0.05),在实性/多囊型AB中LC3表达的阳性率显著高于其他三型(P0.05),而在性别、年龄及是否复发方面差异无统计学意义(P0.05);LAMP2定位于AB上皮细胞的细胞质及细胞膜,其在AB中表达的阳性率及定量检测结果均高于NOM(P0.05),在发生于下颌骨的AB中LAMP2表达的阳性率显著高于发生于上颌骨及牙龈者(P0.05),而在性别、年龄、病理分型及是否复发方面差异无统计学意义(P0.05)。(2)WB结果显示,AB与NOM相比,Beclin1的表达水平较低,而LC3、LAMP2的表达水平较高(P0.05)。(3)结合课题组前期对AB及NOM中Human miRNA表达谱芯片检测的结果,在表达下调的miRNA中,发现与细胞自噬相关的miRNA-1-3p在AB中表达下调显著,在AB中的表达量仅为NOM的0.06倍。经生物信息学分析发现,miRNA-1-3p可能为LAMP2的上游调控分子,选定miRNA-1-3p为进一步研究对象。(4)qRT-PCR结果显示,在AB组织与NOM组织中、AM-1与Hacat中,LAMP2表达上调,miRNA-1-3p表达下调,差异有统计学意义(P0.05)。(5)Spearman相关分析发现,AB组织中LAMP2的表达与miRNA-1-3p的表达呈负相关关系(r=-0.888,P0.05)。1、结论:(1)AB组织中自噬水平升高,溶酶体活性增强,可能与AB易复发及局部侵袭的生物学行为有关。(2)LC3和LAMP2在AB中高表达,可作为AB诊断的参考标记物。(3)miRNA-1-3p在AB中表达下调,其可能是LAMP2潜在的上游调控分子,可通过靶向调控LAMP2影响AB自噬,并进一步影响其生物学行为。
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R739.8
【图文】：

细胞质

（1）Beclin1 的表达与分布Beclin1 以在细胞质及细胞核中出现棕黄色颗粒为阳性表达。免疫组织化学染色发现，Beclin1 在 NOM 中多呈阳性表达（图 3.1）；Beclin1 在 AB 中主要分布于 AB 上皮细胞的细胞质，阳性率高时细胞核亦有着色。在 104 例 AB 组织中Beclin1 的阳性表达率为 50%（52/104），显著低于 NOM 组织（95%，19/20）差异有统计学意义（P < 0.05）。Image J 定量分析结果显示，Beclin1 在 NOM 中的表达是 AB 中的 1.51 倍（P＜0.05），见表 3.1 及图 3.3。（2）Beclin1 的表达与 AB 患者临床病理因素的关系按 2017 年 WHO 头颈部肿瘤分类第 4 版将 104 例 AB 进行分型：实性/多型占 79.81%（83/104），单囊型占 11.53%（12/104），骨外/外周型占 5.77%（6/104）促结缔组织增生型占 2.88%（3/104）。Beclin1 在 AB 各病理分型中均有表达（图3.2）。AB 中 Beclin1 的表达在患者年龄、性别、病变部位、病理分型及是否复发方面的差异均无统计学意义（P > 0.05），见表 3.2。

细胞质,细胞核,头颈部肿瘤,多型

牙龈,上颌骨,下颌骨,性别

图 3.3 Beclin1 在 AB 及 NOM 中的表达情况表 3.2 Beclin1 的表达与 A临床病理因素病例（例年龄 >50 3≤50 7性别男 6女 4位置下颌骨 8上颌骨及牙龈 2

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