冻存骨髓基质细胞在诱导条件下成骨潜能的实验研究

发布时间：2020-07-07 17:25

【摘要】： 目的：骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells，BMSCs)作为间充质细胞，具有多向分化潜能，是一种理想的骨组织工程的种子细胞，有着广泛的应用前景。随着细胞生物学及组织工程学研究的深入和发展，对BMSCs的需求量越来越大，故对其进行长期、大量的保存十分必要。本实验通过对冻存一年后Beagle犬BMSCs进行复苏，传代扩增与诱导分化，探讨冻存后BMSCs在体外的成骨潜能，同时，建立实验动物模型，探讨冻存BMSCs与胶原膜构建细胞和支架材料复合体在裸鼠体内的成骨能力，为进一步研究BMSCs修复颌骨缺损、牙周组织缺损的临床应用提供科学依据。方法：本研究分为体外细胞实验和动物体内实验两个部分：第一部分冻存骨髓基质细胞体外成骨潜能的实验研究：选取于液氮中冻存11个月后的成年Beagle犬BMSCs复苏后进行体外扩增培养，并在实验组传代培养中加入10~(-8)mol／L地塞米松、50mg／L维生素C和10mmol／Lβ-甘油磷酸钠进行诱导分化，对照组未加矿化诱导液，对比观察细胞生长形态、细胞诱导前后增殖情况、细胞碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)含量以及形成矿化结节能力的改变。第二部分冻存骨髓基质细胞和胶原膜复合材料在裸鼠体内的成骨潜能研究：体外分离培养Beagle犬BMSCs，冻存二代生长状况良好的BMSCs。12个月后，复苏冻存的BMSCs，并在体外构建BMSCs和0.5×0.5cm~2大小的BME-10X复合体。将胶原膜+BMSCs+矿化诱导培养液、胶原膜+BMSCs+基础培养液、单纯胶原膜+矿化诱导培养液培养5天后，植入裸鼠体内，并于术后第4，8，12周取出标本，进行大体观察和组织病理学分析。结果：第一部分：冻存BMSCs复苏后呈成纤维样表现，增殖力强。体外矿化结节形成检测发现，常规非诱导培养组细胞于3周左右其中央部分细胞形成细胞团，此细胞团最终形成钙化结节。诱导培养组细胞5天后即出现矿化结节状。检测冻存BMSCs增殖情况发现，复苏后非诱导BMSCs和诱导BMSCs细胞在1～2天生长缓慢，从第3天起快速增长，于第7天达最高峰。非诱导BMSCs在各个时间点上的A值均高于诱导组；诱导组BMSCs增殖能力降低，生长比较平缓。检测冻存BMSCs的ALP活性发现，随着培养时间的延长，非诱导和诱导BMSCs的ALP平均值均增加。4天时两组无明显差别，但随着培养时间延长，诱导组细胞ALP活性增加更为明显。第二部分：单纯胶原膜+诱导培养液组在植入胶原膜后，胶原膜边界清晰，膜边缘及内部基本没有细胞生长；在胶原膜+BMSCs+基础培养液组，术后第4周可见，胶原膜内有细胞长入，并有细小的条索状新生胶原形成，随着时间的延长，支架胶原逐渐分解，新形成的条索状胶原纤维变粗大；在胶原膜+BMSCs+矿化诱导培养液组，植入后也可见支架胶原的分解和更多的细胞生长，大量新生的胶原形成类骨质样组织。结论：1、冻存BMSCs复苏传代后，在体外培养条件下仍保持了较高的细胞存活率、细胞增殖及成骨分化能力，与未矿化诱导相比，经矿化诱导后BMSCs的增殖能力下降，但分化能力增强。 2、冻存BMSCs复苏后在胶原膜支架材料上生长良好；细胞支架材料复合物移植到裸鼠体内后，随着时间的延长，支架材料逐渐降解，细胞持续分泌细胞外基质，类骨质组织逐渐增多。矿化诱导组较非诱导组增加更明显。 3、冻存BMSCs复苏后进行培养扩增与诱导分化，不仅在体外培养条件下该细胞仍保持了较高的细胞增殖及成骨分化能力，而且该细胞在体内环境下复合支架材料，仍具有较强成骨能力，是目前最有希望在临床广泛使用的骨组织工程种子细胞。说明冻存可以保持BMSCs的成骨定向分化能力，这为今后大量使用同一来源的冻存种子细胞进行组织工程修复重建研究提供了坚实的理论基础。
【学位授予单位】：福建医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：R78
【图文】：

生长曲线,生长曲线

图4BMSCs和诱导BMSCs增殖生长曲线2.5冻存BMScs的ALP活性检测ALP检测结果发现，随着培养时间的延和诱导毗SCs的ALPA值(含量)均增加。4d时2组无明显差别，但诱导的A值明显高于非诱导组(只0.05)。随着诱导时间延长，ALP活性增(表1)。表1BMSCs和诱导BMSCs的ALP活性的比较U/Lt(细胞培养时间)/dMSCs分组—4710非诱导组诱导组5.81士2.9510.11士3.5510.95士2.6816.90士1.99*15.11士425.87士3B毗Cs:骨髓基质细胞;ALP:碱性磷酸酶。

【参考文献】