绿色荧光蛋白转基因小鼠舌癌模型的建立和荧光表达观察

发布时间：2020-08-22 07:05

【摘要】：背景：口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma(OSCC))是世界上最常见的恶性肿瘤之一,全世界每年几乎有超过350000人被诊断出患有OSCC。[1]其发生和发展是一个多步骤、阶梯式的过程,且自始至终需要有致癌因素导致的遗传学改变的不断积累。建立与人类口腔癌相似的动物模型,有利于探讨口腔癌的病因、发生、发展、浸润和转移。口腔癌动物模型的建立方法有多种,化学试剂诱导发生口腔恶性肿瘤是最常见的一种。水溶性致癌剂4-硝基喹啉-1-氧化物(4-nitro-quinoline-1-oxide,4NQO)是一种化学前体致癌剂,近年来学者采用4NQO涂布或饮水法成功地诱导大鼠舌癌病变。槟榔碱(Arecoline)是槟榔中的提取物,目前发现用于多种动物的多种诱癌模型,包括肺,肝,胃。不同种系的鼠对4NQO诱发舌癌的敏感性有所不同,目前国内对小鼠舌癌模型的报道仅限于Balb/c品系的小鼠而未见C57BL/6品系小鼠的报道,诱癌剂均单纯运用4NQO。本研究尝试单独和联合运用4NQO和槟榔碱(Arecoline)模拟有咀嚼槟榔习惯的口腔癌患者的病因元素,有助于进一步研究口腔癌的病因和发病机制。为活体荧光影像系统的建立重要的实验动物模型。目的：本研究利用化学致癌剂4-硝基喹啉-1-氧化物(4NQO)和槟榔碱(Arecoline),构建GFP转基因Babl/c和C57BL/6小鼠舌癌模型并观察其余脏器相关病变,对小鼠舌组织病理形态进行动态观察,并对诱癌剂的不同剂量及不同方法,两个鼠种的诱癌过程和诱癌率进行比较,以期获得与人类舌癌发生发展最相似及诱癌率高的病变模型的诱癌方法。同时实验以绿色荧光蛋白转基因小鼠为实验对象,通过观察绿色荧光蛋白在GFP转基因小鼠癌变过程中组织里的表达情况。为活体荧光影像系统的建立提供重要实验依据,为相关的基础研究提供动物模型与细胞来源。方法：以GFP转基因Babl/c和C57BL/6两个种系小鼠为实验对象,通过分别单独和联合应用4NQO和Arecoline,尝试不同浓度饮水和涂布两种方法建立小鼠舌癌及淋巴结转移模型。观察绿色荧光蛋白在GFP转基因小鼠癌变过程中组织里的表达情况。主要构建方法如下：随机选取GFP转基因小鼠按种系不同分为两组。A组为GFP转基因Balb/c近交系小鼠；B组为GFP转基因C57BL/6近交系小鼠；各70只。A、B两组又各随机分为7个亚组,每个亚组10只,第1组为对照组饮用自来水；2-7组为实验组,实验组分别以涂布法5mg/ml4NQO;自然饮水法20μg/ml,50μg/ml,100μg/ml4NQO,500μg/mlArecoline,及联合应用100μg/ml4NQO和500μg/mlArecoline。各组诱癌剂饮用至16周时,改为饮用灭菌自来水观察至第40周,于诱癌的不同节点选取状态不佳,体重下降超过20%的小鼠处死,取其舌头、食管、胃、肝、脾脏组织标本,通过肉眼和组织学观察肿瘤发生发展情况。绿色荧光蛋白在GFP转基因小鼠癌变过程中组织里的表达观察：①癌变过程中的不同节点处死小鼠后选取新鲜舌头置于分子成像系统观察对比GFP在肿物和周围组织中的表达。②新鲜病变舌组织行冰冻切片,在荧光显微镜下观察组织荧光表达,记录GFP在癌变不同进程阶段组织中的表达情况。③成功建模后取小鼠新鲜舌头肿物原代培养,观察细胞培养形态,置于荧光显微镜下动态记录肿瘤细胞的荧光表达情况。结果：对照小鼠舌背粘膜呈粉红色富有弹性,舌体柔软,舌乳头分布均匀,无白色样变和新生物形成。随着诱癌剂作用时间和观察时间的延长,实验小鼠的舌粘膜相继出现充血水肿、红白斑、疣状新生物、溃疡等改变。病理学证实A组GFP转基因Babl/c和B组C57BL/6实验小鼠舌粘膜皆出现由过度角化-轻度异常增生-中度异常增生-重度异常增生-原位癌-浸润性癌的改变。其中A组GFP转基因Babl/c小鼠诱癌情况如下：A2组80.0%(8/10)为过度角化,20.0%(2/10)为轻度异常增生,10.0%(1/10)为中度异常增生；A3组40.0%(4/10)为过度角化,60.0%(6/10)为轻度异常增生,20.0%(2/10)为中度异常增生,10.0%(1/10)为重度异常增生；A4组60.0%(6/10)为过度角化,70.0%(7/10)为轻度异常增生,40.0%(4/10)为中度异常增生,20.0%(2/10)为重度异常增生,10.0%(1/10)为原位癌；A5组90.0%(9/10)为过度角化,70.0%(7/10)为轻度异常增生,40.0%(4/10)为中度异常增生,30.0%(3/10)为重度异常增生,20.0%(2/10)为原位癌,10.0%(1/10)为早期浸润癌；A6组20.0%(2/10)为过度角化；A7组90.0%(9/10)为过度角化,10.0%(1/10)为轻度异常增生,20.0%(2/10)为中度异常增生,40.0%(4/10)为重度异常增生,20.0%(2/10)为原位癌,20.0%(2/10)为浸润癌,10.0%(1/10)淋巴结转移,20.0%(2/10)食管异常增生。 B组GFP转基因C57BL/6小鼠诱癌情况如下：B2组30.0%(3/10)为过度角化,20.0%(2/10)为轻度异常增生；B3组50.0%(5/10)为过度角化,60.0%(6/10)为轻度异常增生,10.0%(1/10)为中度异常增生；B4组50.0%(5/10)为过度角化,40.0%(4/10)为轻度异常增生,20.0%(2/10)为中度异常增生,30.0%(3/10)为重度异常增生,10.0%(1/10)为原位癌；B5组50.0%(5/10)为过度角化,40.0%(4/10)为轻度异常增生,30.0%(3/10)为中度异常增生,30.0%(3/10)为重度异常增生,10.0%(1/10)为原位癌,20.0%(2/10)为浸润癌。B6组20.0%(2/10)为过度角化；B7组80.0%(8/10)为过度角化,10.0%(1/10)为轻度异常增生,10.0%(1/10)为中度异常增生,40.0%(4/10)为重度异常增生,10.0%(1/10)为原位癌,70%(7/10)为浸润癌；10%(1/10)颈部淋巴结转移,20%(2/10)食管异常增生。结论：1.4NQO能成功建立小鼠产生舌癌模型,100μg/ml浓度4NOO诱发的病变模型生长缓慢组织病理学特征与人相似。联合运用Arecoline和4NQO是诱癌率最高的建模方法。 2.C57BL/6小鼠相较Babl/c小鼠诱癌率高,死亡率低,更适宜作为诱癌效率高的模型对象。 3.GFP在舌组织癌变过程中丢失,此模型不宜作为构建荧光肿瘤细胞来源模型。
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R739.86

【参考文献】