脂联素及其受体对牙周炎影响初探

发布时间：2020-09-19 11:52

　　研究目的:通过对健康人牙龈成纤维细胞(human gingival fibroblasts,HGFs)的原代培养,测定其在健康及体外模拟牙周炎状态下脂联素受体(Adiponectin receptor,AdipoR)信使核糖核酸(messenger ribonucleic acid,mRNA)的表达,并观察脂联素(Adiponectin,APN)对牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,P.g)脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激HGFs免疫炎症反应的调控,以初步揭示脂联素及其受体对牙周炎的影响,为进一步揭示肥胖相关疾病与牙周炎相关性的内在机制及辅助治疗提供实验依据。研究方法:选取自2017年03月至2017年05月因拔除埋伏阻生智齿在天津医科大学口腔医院颌面外科就诊的患者(年龄18-24岁,平均年龄22岁),排除患有全身系统性疾病如糖尿病、心血管病等病史,妊娠,吸烟,近3个月内使用抗生素者,患者知情同意,在术中收集新鲜且色形质健康、无明显炎症的的牙龈组织。(1)运用组织块贴壁法从体外培养HGFs,选取4-6代细胞进行实验。(2)从健康HGFs中提取总RNA,逆转录法合成互补的DNA(complementary DNA,cDNA),反转录聚合酶链式反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)检测HGFs中脂联素受体(AdipoR1、AdipoR2)mRNA表达。(3)分别用P.g LPS、TNF-α、APN刺激HGFs 24h。细胞刺激情况如下:TNF-α50ng/ml,P.g LPS 0.1μg/ml,APN 1μg/ml,空白对照(10%FBS培养基)。(4)上述方法刺激细胞后,运用实时定量聚合酶链式反应(real time polymerase chain reaction,real-time PCR)检测不同时间点(0、0.5、12、24h)HGFs中脂联素受体(AdipoR1、AdipoR2)mRNA表达水平。(5)分别用P.g LPS、APN+P.g LPS刺激HGFs达24h。细胞刺激的情况如下:2μg/ml P.g LPS,2μg/ml P.g LPS+1μg/ml APN,空白对照(10%FBS培养基)。(6)上述方法刺激细胞后,运用real-time PCR法检测不同时间点(6、8、24h)HGFs中肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白介素-6(Interleukin-6,IL-6)、前列腺素E2(Prostaglandin-E2,PGE_2)、基质金属蛋白酶1(matrix metalloproteinase-1,MMP-1)的mRNA表达水平。(7)采用IBM SPSS Statistics 23.0统计软件进行数据分析,做描述性分析;计数资料表示:均数±标准差;单因素分析采用One-way ANOVA来分析,析因设计采用析因分析,当p0.05时认为有统计学差异。结果:(1)运用组织块贴壁法从组织块中成功培养出HGFs。在显微镜下仔细观察显示:原代培养约6-8天后有细胞从组织块中爬出,传代后细胞形态为趋于一致的长梭形。免疫组化结果显示:细胞抗角蛋白染色呈现阴性,抗波形丝蛋白染色呈现阳性,证实我们培养的细胞为来源于中胚层的人牙龈成纤维细胞。(2)RT-PCR显示人牙龈成纤维细胞均表达AdipoR1和AdipoR2,其中AdipoR2条带亮度较AdipoR1亮度更高,提示在牙龈结缔组织中成纤维细胞脂联素受体可能主要以AdipoR2为主,进一步探讨需siRNA实验和蛋白实验证实。(3)与空白对照组相比,TNF-α下调了HGFs的AdipoR2 mRNA表达(p0.05),P.g LPS与APN明显上调了HGFs的AdipoR1/R2 mRNA的表达(p0.05)。(4)P.g LPS促进HGFs分泌PGE_2、IL-6、MMP-1及TNF-α,在P.g LPS各炎性介质最佳刺激时间点,APN可显著抑制P.g LPS刺激HGFs分泌IL-6及MMP-1(p0.05),APN可促进P.g LPS刺激HGFs分泌PGE_2和TNF-α,但与P.g LPS对照组相比无统计学意义(p0.05)。结论:(1)脂联素受体(AdipoR1、AdipoR2)在人牙龈成纤维细胞中均有表达,且主要以AdipoR2为主,提示脂联素可以通过内分泌方式作用于牙周组织。(2)APN可抑制P.g LPS刺激HGFs分泌IL-6及MMP-1,抑制病原微生物在牙周炎致病过程中所起的作用,产生抗炎、抗骨吸收和基质降解等作用。。(3)在牙周炎症状态下,脂联素与其受体作用效能下降,致使已有的牙周炎症进一步加重,及时清创治疗和辅助APN等局部药物治疗对于控制炎症、防止病情加重意义重大。
【学位单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R781.42
【部分图文】：

细胞,牙龈组织,原代培养,细胞的

一、HGFs 中脂联素受体的表达及 TNF-α、P.g L医科大学硕士学位论文对其影响原代培养的 HGFs 的形态学观察在静置 4 小时后，我们可见大多数的牙龈组织贴附在细胞培养瓶底后，在倒置显微镜下可见组织块边缘隐隐约约有成纤维细胞样呈梭形（图 1A），在游出细胞的头部我们可见到其伪足结构十分清晰，并极性很强，在生长很密集的地方，我们可以看到细胞排列呈现十分明形状，同时伴随着原代培养时间的延长，牙龈组织块四周显示细胞密，并彼此融合同时与从相邻的组织块爬出的细胞相互交汇（图 1B）至培养瓶 80%时，即可传代，传代后我们发现细胞呈长梭形，部分原代培养和传代生长的 HGFs 细胞均呈现成纤维细胞样，而且在其四看到多个突起，在细胞的中央可见圆形或卵圆形的细胞核，核内核细胞呈分裂相，细胞整体走向为放射状、漩涡状走行（图 1C、D）果

脂联素及其受体对牙周炎影响初探

RT-PCR检测在健康HGFs中AdipoR1、AdipoR2的表达Figure3TheexpressionofAdipoR1andAdipoR2inhealthyHGFsviaRT-PCR

组织来源,纯度,免疫组织化学

图 2 HGFs 组织来源的鉴定（免疫组织化学 SP 法)Figure 2 Identification of source of HGFs(Immunohistochemistry SP) 健康 HGFs 脂联素受体的表达.1 RNA 样品纯度的测定根据 260nm 及 280nm 处吸光度数值计算:OD260/OD280=0.496/0.271抽提的 RNA 纯度是较高的。.2 琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 产物的结果HGFs 有 AdipoR1、AdipoR2 的表达，且琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 产基因片段与预期一致（图 3）。

【参考文献】